Ensayo de modulación del pH en bicapas lipídicas soportadas para detectar interacciones proteína-fosfoinositida

El fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato, o PIP2, es un fosfolípido fosforilado menor unido a la membrana. La fosfolipasa C, o PLC, con dominios específicos de unión a PIP2, se une a PIP2, generando mensajeros secundarios esenciales para varios procesos celulares.

Para detectar interacciones PLC-PIP2 in vitro, comience con una pequeña vesícula unilamelar, SUV, suspensión ácida, que comprende PIP2 y una mezcla de fosfolípidos, una de las cuales se conjuga con un colorante fluorescente sensible al pH.

Pipetee la solución en la tubería de entrada y salida de un dispositivo microfluídico fabricado preensamblado. Transfiera y asegure el dispositivo a una platina de microscopio de fluorescencia. A través de la gravedad, los SUV pasan a través del piso de microcanales, hecho de un cubreobjetos de vidrio hidrófilo.

Los SUV se adsorben en la superficie del vidrio, el pH de la solución reduce la repulsión electrostática entre los dos. Los SUV interactúan con la superficie, deformándose y fusionándose para formar grandes vesículas.

Después de una cobertura superficial crítica, las vesículas se rompen espontáneamente, formando una bicapa lipídica soportada, SLB. Pase un amortiguador a través del canal, eliminando las vesículas no adsorbidas.

Usando un canal de fluorescencia adecuado, obtenga imágenes del microcanal para visualizar y medir la fluorescencia del colorante sensible al pH, altamente fluorescente a pH bajo, en el SLB.

Introduzca una solución de PLC recombinante en el microcanal. El pH neutro de la solución, por debajo del punto isoeléctrico del PLC, hace que el PLC se cargue positivamente.

El PLC recombinante, con su dominio de unión a PIP2, se une al PIP2, reclutando iones de hidróxido cargados negativamente en la superficie de la bicapa. Esto hace que la superficie de la bicapa sea más básica, cambiando el estado de protonación del tinte y provocando un enfriamiento de fluorescencia, lo que indica interacciones PLC-PIP2.

Transfiera 100 microlitros de fosfatidilinositol-4 5-bisfosfato que contiene pequeñas vesículas unilamelares a un tubo de microcentrífuga de 0,65 mililitros. Ajuste el pH de la solución a aproximadamente 3,2 agregando 6,4 microlitros de ácido clorhídrico 0,2 normal.

Pipetee 10 microlitros de la solución de vesícula unilamelar pequeña con pH ajustado en cada canal a través de la entrada y aplique presión a través de la pipeta hasta que la solución llegue a la salida. Separe la punta de la pipeta y déjela unida al dispositivo. Después de repetir este paso para cada canal, incube el dispositivo durante 10 minutos a temperatura ambiente.

La inyección de vesículas en microcanales debe realizarse inmediatamente después del ensamblaje del dispositivo. Mientras tanto, corte juegos de tubos de entrada y salida. Con unas pinzas, conecte el juego de tubos de salida al dispositivo y luego pegue el dispositivo con cinta adhesiva en una platina de microscopio.

Sumerja un extremo del conjunto de tubos de entrada en 25 mililitros de tampón de funcionamiento contenido en un tubo cónico y péguelo con cinta adhesiva para asegurarse de que el tubo esté asegurado. Con un gato de laboratorio, coloque el tubo cónico en un terreno más alto que el dispositivo para empujar la solución a través de los microcanales a través del flujo por gravedad.

Para cada tubo de entrada, use una jeringa para extraer 1 mililitro de tampón de funcionamiento del extremo libre del tubo. Retire la punta de la pipeta de la entrada e inserte el extremo libre del tubo de entrada en el dispositivo. Repita este proceso para conectar todas las piezas del tubo de entrada al dispositivo. El flujo del amortiguador a través de los canales ayuda a eliminar el exceso de vesículas no rotas y equilibrar la bicapa en condiciones experimentales.

A continuación, abra el software de control del microscopio. En el panel izquierdo, haga clic en la pestaña "Microscopio" y elija el objetivo "10x". Haga clic en "En vivo" y luego, en los íconos de imagen "Alexa 568" en la barra de herramientas. Usando las perillas de ajuste Fino y Grueso, concéntrese en los microcanales. Escanee el dispositivo para verificar la calidad de los SLB y los canales.

Luego, haga clic en el icono de imagen "Obturador FL cerrado" en la barra de herramientas. Haga clic en la pestaña "Adquisición" y, en "Ajustes básicos", seleccione el tiempo de exposición. Ajuste el tiempo de exposición a 200 milisegundos. En el panel izquierdo, haga clic en "Adquisición multidimensional". En el menú "Filtros", seleccione el canal rojo. Luego, haga clic en el menú "Lapso de tiempo". Establezca el intervalo de tiempo en 5 minutos, la duración en 30 minutos y el menú de lapso.

Seleccione la herramienta "Círculo" en la pestaña "Medir" y dibuje un círculo en cualquier canal. Haga clic con el botón derecho mientras el círculo está seleccionado y elija "Propiedades". En la pestaña "Perfil", marque "todas las T" para ver la intensidad de la fluorescencia en función del tiempo. Asegúrese de que esta curva alcance una meseta, lo que indica equilibrio, antes de continuar con el siguiente paso.

Baje la solución tampón a una tierra igual a la del dispositivo para detener el flujo. Uno a la vez, separe cada tubo de salida y aplique 200 microlitros de cada dilución de proteína en el canal de salida con una pipeta. No aplique ninguna presión. Deja que la gravedad haga el trabajo. Separe la punta de la pipeta y déjela unida al dispositivo microfluídico. Repita este proceso para cada canal y asegúrese de que no se introduzcan burbujas de aire en los canales durante este proceso.

A continuación, baje el tubo de entrada a un suelo debajo del dispositivo microfluídico para comenzar a hacer fluir la proteína a través de los microcanales. Pegue con cinta adhesiva el extremo libre del tubo a un contenedor de desechos. Fluya las diluciones del dominio de homología de Pleckstrin durante 30 minutos. En el panel izquierdo del software, en la pestaña "Lapso de tiempo", haga clic en "Inicio" para comenzar a crear imágenes nuevamente.