Cromatografía de exclusión por tamaño con dispersión de luz multiángulo para oligómeros de proteínas

Un oligómero de proteína es un complejo de múltiples subunidades de proteínas que se unen para formar una unidad funcional más grande.

Para determinar el peso molecular de los monómeros de proteínas y sus oligómeros en solución mediante SEC-MALS, una combinación de cromatografía de exclusión por tamaño y dispersión de luz de múltiples ángulos, comience con una columna de cromatografía de exclusión por tamaño, o SEC.

La columna contiene perlas de gel esféricas porosas en forma de tamiz que atrapan moléculas de menor tamaño dentro de ellas. Equilibre la columna con un tampón compatible con el estado nativo de la proteína.

Cargue una muestra que contenga monómeros y oligómeros de proteínas en la parte superior de la columna.

Durante el flujo, los oligómeros pasan a través del espacio entre partículas de la columna, mientras que los monómeros quedan atrapados dentro de los poros de las perlas. Esto hace que los oligómeros de proteínas de mayor tamaño viajen más rápido que los monómeros de menor tamaño.

Dirija los oligómeros de liberación rápida, seguidos de los monómeros de liberación lenta, al detector MALS.

A medida que pasan por el detector, una luz láser los ilumina, que se dispersa en diferentes ángulos. Los oligómeros de múltiples subunidades dispersan más luz que el monómero.

La intensidad de la luz dispersa en múltiples ángulos es directamente proporcional al peso molecular del oligómero y monómero de la proteína.

Comience este procedimiento con la preparación del sistema SEC-MALS como se describe en el protocolo de texto. Con reactivos de grado HPLC, prepare un litro de solución salina tamponada con fosfato con 50 a 100 mililitros de cloruro de sodio. Filtre el tampón a 0,1 micras utilizando un filtro de poliéter sulfona en la parte superior de una botella o similar.

Filtre los primeros 50 a 100 mililitros de tampón a una botella de desechos para eliminar las partículas de los filtros secos. Luego, filtre el resto a una botella limpia y estéril que haya sido previamente lavada con agua filtrada y desionizada y guardada para evitar que entre polvo.

Enjuague la columna durante la noche a un caudal de 0,5 mililitros por minuto para equilibrar la columna en el tampón y eliminar las partículas. Utilice el modo de "flujo continuo" del FPLC y asegúrese de que el flujo no se detenga hasta que se completen todas las ejecuciones de SEC-MALS. Coloque la celda de flujo dRI en modo de purga durante el lavado nocturno.

Al comenzar la descarga, aumente gradualmente el caudal para evitar el efecto de "desprendimiento de la columna" causado por un cambio repentino de presión en la columna. Desactive la purga antes de comenzar las ejecuciones de muestra.

Verifique la limpieza del sistema golpeando ligeramente el tubo aguas abajo de la columna para liberar las partículas acumuladas. Observe la señal en el detector de 90 grados en la pantalla del panel frontal del instrumento MALS. Verifique que el ruido de pico a pico no sea más de 50 a 100 microvoltios. Además, verifique que el índice de refracción o la señal RI sea estable a menos de 1 x ^{10-7 unidades de índice de} refracción.

Realice una inyección "en blanco" para verificar que el inyector esté limpio de partículas. Un "espacio en blanco" es simplemente el tampón de funcionamiento preparado en un vial estéril fresco. Si el pico de partículas no tiene más de 1 mililitro de volumen y no más de 5 milivoltios por encima de la línea de base, entonces el sistema está listo para las muestras. De lo contrario, realice inyecciones adicionales en blanco hasta que estén limpias o realice el mantenimiento para limpiar el inyector.

Ahora, prepare al menos 200 microlitros de BSA a 1 a 2 miligramos por mililitro en el tampón SEC. Filtre la proteína a 0,025 micras con un filtro de punta de jeringa. Deseche las primeras gotas de filtrado para eliminar las partículas de los filtros secos. Alternativamente, centrifugue la muestra a 10,000 veces g durante 15 minutos para permitir la precipitación de agregados no solubles y otras partículas grandes. Luego, inyecte 100 microlitros de la solución de BSA en el bucle.