Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 7:16 min. • July 8th, 2025
La calorimetría diferencial de barrido ayuda a estudiar las interacciones biomolécula-ligando midiendo el calor necesario para desnaturalizar la biomolécula en ausencia y presencia del ligando.
Para comenzar, tome una referencia que contenga aptámeros de ADN libres, oligonucleótidos monocatenarios estructurados, y una muestra que contenga aptámeros unidos a ligandos termolábiles. Los ligandos estabilizan la estructura secundaria del aptámero.
Realice un escaneo hacia adelante calentando las soluciones. Al alcanzar la temperatura de fusión, los aptámeros libres se desnaturalizan.
Los aptámeros estabilizados con ligandos se disocian de los ligandos y se desnaturalizan a una temperatura relativamente más alta, lo que provoca un aumento en la temperatura de fusión en comparación con los aptámeros libres. A altas temperaturas, un subconjunto de ligandos obtiene una forma secundaria irreversible con una baja afinidad de unión.
A continuación, realice un escaneo inverso enfriando las soluciones para recuperar la estructura del aptámero. A la temperatura más baja, los ligandos iniciales y convertidos de la muestra se unen a los aptámeros.
Durante el segundo escaneo directo, los aptámeros unidos con una afinidad débil a los ligandos convertidos se disocian y desnaturalizan a una temperatura más baja que los aptámeros unidos al ligando iniciales, lo que provoca una disminución de la temperatura de fusión.
Con exploraciones sucesivas, los ligandos continúan convirtiéndose a la forma secundaria, lo que resulta en el agotamiento completo de la forma inicial. Obtén el termograma.
Con cada escaneo, la temperatura de fusión del aptámero unido al ligando se desplaza hacia el aptámero libre, lo que indica la débil afinidad de unión de la forma secundaria.
Desgasifique las soluciones de tampón, biomolécula y ligando en un desgasificador de mesa antes de cargarlas en el calorímetro diferencial de barrido o DSC. Desenrosque el mango de presión del DSC. Luego, pase un tubo de silicona desde el tampón de trabajo y conéctelo a la brida frontal del capilar de referencia.
Cree un puente entre los capilares de referencia y de muestra conectando la brida de referencia trasera a la brida de muestra frontal. A continuación, conecte un trozo de tubo de silicona a la brida de muestra trasera que se extiende a un matraz de residuos con una línea de vacío conectada. Encienda la línea de vacío para enjuagar el DSC con 200 mililitros de tampón de trabajo.
Comience conectando secciones de aproximadamente 3 a 5 centímetros de tubo de silicona a las bridas capilares de referencia. A continuación, inserte una punta de pipeta de 1 mililitro en el tubo de silicona de la brida trasera. Extraiga 0,8 mililitros de tampón de trabajo con una pipeta e inserte la punta de la pipeta con tampón en el tubo de silicona de la brida de referencia frontal.
Presione suavemente el émbolo de la pipeta hacia abajo para pasar el tampón de trabajo a través del tubo de silicona frontal hacia el capilar de referencia y hacia arriba en la punta de la pipeta adjunta de la brida trasera. Presione el émbolo de la pipeta hacia abajo hasta que el nivel del amortiguador de trabajo llegue justo por encima del tubo de silicona frontal. A continuación, suelte el émbolo de la pipeta hasta que el nivel del amortiguador de trabajo llegue justo por encima del tubo de silicona trasero. Continúe pasando el tampón de trabajo hacia adelante y hacia atrás en el capilar de referencia para purgar el volumen de burbujas.
A continuación, tape la punta de la pipeta trasera con un dedo índice y tire suavemente hacia arriba de la punta de la pipeta trasera y la pipeta delantera para retirarlas de las bridas de referencia con el tubo de silicona conectado. Cargue el capilar de muestra con tampón de trabajo como antes.
Coloque una tapa de plástico negro en las bridas traseras de referencia y muestra, dejando las bridas delanteras descubiertas. Conecte el mango de presión al DSC y luego, abra el software DSC y presurice el instrumento haciendo clic en la flecha roja "Arriba" en la parte superior de la interfaz una vez que la lectura de potencia se haya estabilizado. La potencia DSC se indica en un cuadro en la parte superior derecha de la interfaz, junto con la lectura de temperatura y presión del instrumento.
Equilibre el DSC con el búfer de trabajo realizando un escaneo hacia adelante y hacia atrás. En la pestaña "Método experimental" en el lado izquierdo de la pantalla, asegúrese de que la opción "Escaneo" esté seleccionada para ejecutar el DSC en modo de escaneo de temperatura.
En el recuadro "Parámetros de temperatura" en la pestaña "Método experimental", haga clic en el botón para calentar. Ingrese 1 y 100 grados Celsius para las temperaturas experimentales inferior y superior, 1 grado Celsius por minuto para la velocidad de escaneo y 60 segundos para el período de equilibrio. Haga clic en el botón "Agregar serie" debajo del campo de entrada para el período de equilibrio. Ingrese 2 en el campo "Pasos para agregar" en la ventana emergente y marque la casilla "Calefacción / refrigeración alternativa". Haga clic en "Aceptar".
Los escaneos agregados aparecen en la parte inferior de la interfaz. Compruebe que los parámetros de cada análisis son los deseados. Inicie el experimento haciendo clic en el botón verde "Reproducir" en la parte superior de la interfaz. Vaya a la ventana deseada e introduzca un nombre de archivo para guardar el experimento en la ventana emergente. Para ver el progreso del experimento, haga clic en la pestaña "Datos" a la derecha de la pestaña "Método de experimento".
Ejecute experimentos de referencia para la resta de referencia de los datos de la muestra recargando el DSC con tampón de trabajo en ambos capilares. Recopile múltiples escaneos hacia adelante y hacia atrás en un rango de temperatura adecuado a 1 grado Celsius por minuto con un tiempo de equilibrio superior de 120 segundos.
Elimine los escaneos de equilibrio de búfer anteriores de la parte inferior de la interfaz resaltando cada uno individualmente y haciendo clic en la "X" roja en el centro a la derecha de la interfaz.
Agregue los nuevos escaneos haciendo clic en el botón "Agregar serie", ingresando 20 en el campo "Pasos para agregar" y marcando la casilla "Calefacción / refrigeración alternativa". Luego, haga clic en "Aceptar" y ejecute el experimento haciendo clic en el botón verde "Reproducir" como antes.
Repita estos pasos con un tampón de trabajo que contenga la concentración deseada de ligando en ambos capilares para obtener los experimentos de referencia para el ligando. Recopile dos experimentos separados para ser utilizados en la adquisición de la constante de velocidad para la conversión del ligando termolábil.
Para el conjunto de datos de biomoléculas libres, asegúrese de que el capilar de referencia contenga el tampón de trabajo, mientras que el capilar de muestra contenga la biomolécula libre a la concentración deseada en el tampón de trabajo. A continuación, ejecute los experimentos de muestra utilizando el mismo procedimiento de carga de DSC y los parámetros experimentales utilizados en los escaneos de referencia.
Para los experimentos unidos al ligando, asegúrese de que el ligando esté en el tampón de trabajo en el capilar de referencia y que la biomolécula más el ligando estén en el tampón de trabajo en el capilar de la muestra. Enjuague el sistema entre adiciones de diferentes ligandos como antes.
Realice un experimento adicional con la biomolécula unida al ligando termolábil donde el período de equilibrio a alta temperatura se incrementa a 600 segundos, y todos los demás parámetros experimentales son los mismos que antes. Proceda al procesamiento y análisis de datos como se describe en el protocolo de texto.