Ensayo de unión competitiva para identificar compuestos que interrumpen las interacciones receptor-ligando

El ensayo de unión competitiva identifica moléculas pequeñas que interrumpen las interacciones receptor-ligando al unirse competitivamente a un receptor diana, inhibiendo la unión natural del ligando.

Para identificar las interacciones de un receptor con su ligando natural en presencia de un antagonista de molécula pequeña específico del receptor, comience con una suspensión de células de linfocitos T humanos que expresan el receptor objetivo.

Agregue la suspensión celular a los pocillos de una placa de pocillos múltiples que contenga concentraciones crecientes de antagonistas. Incubar. El antagonista se une al sitio de unión ortostérico, el sitio natural de unión al ligando del receptor.

Agregue una concentración fija de ligandos naturales marcados con fluorescencia a los pocillos. Incubar.

A bajas concentraciones, los antagonistas ocupan pocos sitios de unión ortostéricos, lo que permite la unión natural del ligando a los receptores. Sin embargo, a concentraciones más altas, los antagonistas ocupan la mayoría de los sitios de unión ortostéricos, lo que permite una unión natural mínima ligando-receptor.

Centrifugar para peletizar las células. Deseche el sobrenadante. Resuspender las células en paraformaldehído para fijarlas, preservando la morfología celular.

Usando un citómetro de flujo, analice las señales de fluorescencia de los linfocitos T individuales que expresan los receptores unidos al ligando antagonista y fluorescente.

Una disminución dependiente de la dosis en la intensidad media de fluorescencia con el aumento de las concentraciones de antagonistas específicos del receptor indica la unión competitiva de los antagonistas a los sitios de unión del receptor ortostérico, inhibiendo la interacción ligando-receptor natural.

Para comenzar, dispense 100 microlitros de solución compuesta en una placa transparente de fondo redondo de 96 pocillos de acuerdo con un diseño experimental predefinido.

Agregue 50 microlitros de suspensión celular de un depósito de reactivos en la placa de 96 pocillos con una pipeta multicanal. Incube el plato durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

Después de la incubación, agregue 50 microlitros de CXCL12 de 100 nanogramos por mililitro marcados con fluorescencia de un depósito de reactivos similar a los pocillos de la placa de 96 pocillos. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

A continuación, centrifugue la placa de 96 pocillos a 400 veces la gravedad durante 5 minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante de las celdas granuladas volteando la placa. Seque la placa en un pañuelo de papel. Agregue 200 microlitros de tampón de ensayo fresco de un depósito de reactivos a los pocillos con una pipeta multicanal.

Inmediatamente proceda a centrifugar la placa nuevamente durante 5 minutos a 400 veces la gravedad a temperatura ambiente. Nuevamente, retire el sobrenadante volteando la placa y luego secándola con un pañuelo de papel. Finalmente, vuelva a suspender suavemente el sedimento celular en 200 microlitros de paraformaldehído al 1% disuelto en PBS. Este paso arreglará las células.

Para analizar las muestras mediante citometría de flujo, inicie el dispositivo y abra el software correspondiente. Seleccione los parámetros celulares que se visualizarán en un formato de transferencia de puntos como área de dispersión directa, área de dispersión lateral y, en una vista de histograma, el canal de detección de fluoróforos.

Elija una muestra, por ejemplo, una muestra de control negativo, para realizar la activación de una población de células homogénea definida en función de los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral. Adapte la configuración para cargar las células en el dispositivo de citometría de flujo.

Seleccione tres mezclas antes de la inyección. Seleccione la inyección automática de 100 microlitros de células fijadas y utilice un caudal de muestra de 1,5 microlitros por segundo. Ejecute el ejemplo seleccionando "Adquirir datos". Los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral para esta muestra, así como la detección de fluoróforos, ahora aparecerán en la pantalla.

Ahora, seleccione la herramienta de compuerta del software. Basado en la visualización del gráfico de dispersión directa y dispersión lateral, predefina una población de células homogénea y viable mediante gating. Seleccione para analizar 20.000 "eventos" por muestra.

Esto significa que para cada muestra, eventualmente se analizarán 20,000 células que se encuentran dentro de una puerta predefinida. La adquisición de datos continuará hasta que se alcance este número de eventos.

Inicie la ejecución seleccionando primero los pocillos que se van a analizar. Luego, seleccione "Ejecutar pozos".

El dispositivo de citometría de flujo ahora analizará estas muestras una por una registrando la intensidad de fluorescencia media para cada muestra, que corresponde a la señal fluorescente media de las 20,000 células que se encuentran dentro de la puerta predefinida.

Finalmente, realice el análisis de datos como se describe en el protocolo.