JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
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Para estudiar las interacciones receptor-ligando, comience con una placa de múltiples pocillos que contenga medios con células diana que expresen ligandos de prueba en su superficie.
Agregue células BW de ratón modificadas, una nueva población de células B que expresan receptores quiméricos unidos a la membrana. Los receptores quiméricos comprenden el dominio extracelular de un receptor específico fusionado con el dominio de señalización transmembrana e intracelular del receptor de células B.
Los ligandos en las células diana interactúan con el dominio extracelular de los receptores quiméricos de las células BW, lo que provoca la activación del dominio de señalización intracelular en las células BW. Esto desencadena la señalización posterior y la producción de citoquinas, moléculas indicadoras secretoras que se liberan fuera de las células BW y aparecen en los medios.
Centrifugar la placa. Transfiera el sobrenadante que contiene citoquinas a una placa ELISA previamente recubierta con anticuerpos anticitoquinas. Las citocinas interactúan con las regiones Fab de los anticuerpos, lo que lleva a su inmovilización en la superficie de la placa.
Trate la placa con una solución de bloqueo para bloquear los sitios de unión no específicos. Agregue anticuerpos anticitoquinas biotinilados, que interactúan con citocinas preunidas y forman complejos inmunes.
Cubra la placa con una solución de estreptavidina conjugada con enzimas. La estreptavidina se une a la biotina en los complejos inmunes.
Trate la placa con un sustrato. La interacción enzima-sustrato produce un producto coloreado, impartiendo el mismo color a la solución. La solución coloreada confirma la presencia de moléculas reporteras, lo que indica una interacción exitosa entre el receptor y el ligando.
Utilice 50.000 células de peso corporal transfectadas con sus objetivos deseados en un solo pocillo de una placa de 96 pocillos. Incube la placa durante 48 horas. Luego, congele la placa a -20 grados centígrados.
Cubra una placa ELISA con anticuerpo IL-2 anti-ratón. Coloque 0.05% microgramos de anti-ratón-IL-2 en un volumen de 50 microlitros de PBS en cada pocillo. Incube la placa recubierta durante la noche a 4 grados centígrados.
Utilice un breve período de incubación a 37 grados centígrados para descongelar las células de peso corporal congeladas que se incubaron previamente con sus objetivos. Luego, centrifugue la placa y transfiera 100 microlitros del sobrenadante de cada pocillo a la placa ELISA prerrecubierta, e incube a 37 grados centígrados durante 2 horas.
Después de esto, agregue biotina anti-ratón-IL-2 a la placa ELISA. Luego, después de la incubación y el lavado, agregue estreptavidina conjugada con HRP a la placa. Después de la incubación y el lavado, agregue 100 microlitros de la solución de sustrato TMB a cada pocillo de la placa ELISA. Finalmente, lea la placa ELISA a 650 nanómetros.