Sonda de fuerza de biomembrana para cuantificar las interacciones receptor-ligando

La interacción entre un receptor de células T, TCR, y un péptido antigénico presentado por el MHC, o complejo principal de histocompatibilidad, en una célula presentadora de antígeno, APC, hace que la célula T ejerza una fuerza mecánica sobre la APC. Este fenómeno es necesario para la activación de las células T.

Para cuantificar las interacciones receptor-ligando utilizando una sonda de fuerza de biomembrana, BFP, comience con una cámara celular personalizada basada en portaobjetos. Coloque la cámara celular bajo un microscopio.

Inyecte suspensiones de glóbulos rojos hinchados biotinilados, sonda de vidrio recubiertas con complejos MHC-estreptavidina-biotina unidos a péptidos y células T en la cámara. Coloque las micropipetas llenas de tampón de sonda, objetivo y ayudante alrededor de la cámara.

Aspire un eritrocitos biotinilados con la pipeta de la sonda, colocándolo en un área en blanco. Aspire una célula T con la micropipeta objetivo, colocándola a la derecha de los glóbulos rojos. Aspire una perla de sonda con la micropipeta auxiliar y conéctela al ápice de los glóbulos rojos. La estreptavidina de la perla se une a la biotina de los glóbulos rojos y forma una sonda de fuerza.

Alinee la célula T con la sonda de fuerza para permitir que el TCR interactúe con su ligando, el péptido unido al MHC, y que la célula T ejerza fuerza sobre los glóbulos rojos. Retraiga la célula T para romper el enlace TCR-péptido, lo que deforma el RBC y desplaza la perla.

Mida la fuerza necesaria para romper el enlace: un enlace más fuerte necesita una fuerza mayor y más tiempo para romperse, lo que indica una vida útil más larga.

Para comenzar el experimento BFP, encienda el microscopio y la fuente de luz. Coloque la cámara en la platina principal del microscopio. El siguiente paso es instalar las tres micropipetas del BFP. La sonda a la izquierda es agarrar un RBC. El objetivo a la derecha es agarrar la celda, y el ayudante de la parte inferior derecha sirve para agarrar una cuenta.

Para instalar, use un microinyector para rellenar una micropipeta con tampón experimental. Retire la micropipeta del soporte de la pipeta y sosténgala en un lugar más bajo para permitir que el líquido gotee de la punta. Inserte rápidamente la micropipeta en la punta del soporte, asegurándose de que no entre ninguna microburbuja de aire en la micropipeta durante la inserción.

Apriete el tornillo de soporte y, a continuación, monte cada soporte de pipeta en su micromanipulador correspondiente. Empuje la micropipeta hacia la cámara para que sus puntas entren en el área de tampón de la cámara. Ajuste la posición de la micropipeta y encuéntrelas bajo el campo de visión del microscopio.

Muévete por el escenario del soporte de la cámara para encontrar las colonias de los tres elementos una por una. Ajuste la posición de la micropipeta correspondiente girando las perillas de los manipuladores para permitir que la punta de la micropipeta se acerque a una celda o perla. Aspire la celda o el cordón ajustando la presión dentro de la micropipeta correspondiente. Las tres micropipetas capturarán sus elementos correspondientes.

Muévase alrededor de la etapa del soporte de la cámara para encontrar un espacio abierto lejos de las colonias de los elementos inyectados donde se realizará el experimento.

Cambie el modo visual del microscopio para visualizar la imagen en el programa de computadora. Mueva los tres elementos de las puntas de pipeta al campo de visión del programa. A continuación, alinee el cordón de la sonda y el RBC y maniobre con cuidado el cordón de la sonda hasta el vértice del RBC. Ahora, incida brevemente la cuenta en el RBC y retírela suavemente.

Ajuste la presión de la micropipeta auxiliar para soplar suavemente el cordón para que quede pegado al ápice RBC. Aleje la micropipeta auxiliar y alinee el objetivo y el cordón de la sonda.

En el programa, en la ventana Campo de visión, utilice las herramientas del programa para medir los radios respectivos de la micropipeta de la sonda, los glóbulos rojos y el área de contacto circular entre los glóbulos rojos y el cordón de la sonda. Estos valores permiten estimar la constante de resorte de la RBC mediante la ecuación enumerada en el protocolo de texto.

Después de ingresar la constante de resorte RBC deseada en el programa, dibuje una línea horizontal a través del vértice RBC que producirá una curva en la ventana adyacente que indica el brillo de cada píxel a lo largo de esta línea. Arrastre la línea de umbral para que esté aproximadamente a la mitad de la profundidad de la curva.

A continuación, seleccione el modo de experimento deseado. Establezca los parámetros como desee. Haga clic en Inicio, lo que permite que el programa mueva la pipeta de destino y conduzca el objetivo dentro y fuera de contacto con la sonda.

La recopilación de datos se realizará en paralelo, lo que registra la posición del cordón de la sonda en tiempo real. Detenga el programa haciendo clic en el botón Detener experimento, momento en el que aparecerá una ventana para permitir guardar los datos adquiridos.