Ensayo de unión de competición para estudiar socios de proteínas de unión a GTPasa que compiten entre sí

Las proteínas de unión a nucleótidos de guanina, una categoría de GTPasas, funcionan como un interruptor molecular, alternando entre una forma activa unida a GTP y una forma inactiva unida a GDP.

Las GTPasas activas se unen a socios proteicos específicos. Estos socios compiten por el mismo sitio de unión en las GTPasas.

Para estudiar la unión competitiva, comience tomando una suspensión de GTPasa unida a GTP inmovilizada en perlas magnéticas. Agregue el primer compañero de interacción: proteína A etiquetada con fluorescencia. Incube bajo agitación para mantener las perlas en suspensión. La proteína A se une y satura los sitios de unión en todas las moléculas de GTPasa.

Divida esta solución por igual en varios tubos. Agregue un segundo compañero de interacción, la proteína B etiquetada con fluorescencia, a los tubos en cantidades cada vez mayores. Incubar bajo agitación.

La proteína B se une al mismo sitio de unión en las GTPasas, desplazando competitivamente a la proteína A.

Exponga los tubos a un campo magnético para recoger las perlas de un lado. Deseche el sobrenadante para eliminar las proteínas no unidas. Vuelva a suspender las perlas complejadas con proteínas en un tampón adecuado y cuantifique las proteínas unidas.

Grafique las intensidades relativas de las proteínas A y B unidas a GTPasa en cada concentración de proteína B.

La proteína B alcanza un equilibrio, ocupando los sitios de unión de la mitad de las moléculas de GTPasa, a una concentración relativamente más baja que la proteína A, lo que indica la mayor afinidad de la proteína B por la GTPasa.

Para realizar la fijación de competición, configure seis tubos de microfuga, cada uno con 200 microlitros de tampón de fijación de competición. Cada tubo también debe contener 10 microlitros de las perlas Rac1 cargadas con nucleótidos y cinco microlitros de la proteína A de unión a Rac1 como proteína de unión constante.

A cada tubo, agregue 0, 1, 2,5, 5, 10 o 20 microlitros de proteína B de unión a Rac1 como proteína de unión variable. Estos volúmenes asumen concentraciones de stock aproximadamente iguales de las proteínas de unión constantes y variables y es posible que deban ajustarse.

Aumente el volumen total de la mezcla de unión a 235 microlitros mediante la adición del tampón de unión de competición. A continuación, configure un tubo de microfuga que contenga 200 microlitros del tampón de competencia, 10 microlitros de perlas Rac1 cargadas con nucleótidos experimentales y 10 microlitros de proteína A de unión a Rac1.

Luego, configure los tubos de control GDP, GTPγS y sin nucleótidos como se describe en el protocolo de texto. Incubar los tubos durante dos horas, mezclando por inversión a 4 grados centígrados. Después de la incubación, lave las perlas tres veces con el tampón de unión de competición.

Finalmente, eluya las proteínas unidas en 20 microlitros de tampón de muestra reductor.