Ensayo de unión de competición para estudiar socios de proteínas de unión a GTPasa que compiten entre sí

Las proteínas de unión a nucleótidos de guanina, una categoría de GTPasas, funcionan como un interruptor molecular, alternando entre una forma activa unida a GTP y una forma inactiva unida a GDP.

Las GTPasas activas se unen a socios proteicos específicos. Estos socios compiten por el mismo sitio de unión en las GTPasas.

Para estudiar la unión competitiva, comience tomando una suspensión de GTPasa unida a GTP inmovilizada en perlas magnéticas. Agregue el primer compañero de interacción: proteína A etiquetada con fluorescencia. Incube bajo agitación para mantener las perlas en suspensión. La proteína A se une y satura los sitios de unión en todas las moléculas de GTPasa.

Divida esta solución por igual en varios tubos. Agregue un segundo compañero de interacción, la proteína B etiquetada con fluorescencia, a los tubos en cantidades cada vez mayores. Incubar bajo agitación.

La proteína B se une al mismo sitio de unión en las GTPasas, desplazando competitivamente a la proteína A.

Exponga los tubos a un campo magnético para recoger las perlas de un lado. Deseche el sobrenadante para eliminar las proteínas no unidas. Vuelva a suspender las perlas complejadas con proteínas en un tampón ade