Ensayo de microarrays de antígenos virales para detectar isotipos de anticuerpos en suero contra antígenos virales

Comience el ensayo de microarrays de antígenos virales con un portaobjetos de microarrays de antígenos virales preparado.

El portaobjetos contiene múltiples almohadillas, cada una con una sola matriz que contiene cientos de antígenos purificados de múltiples cepas virales impresas en puntos dispuestos en una cuadrícula. Cada punto contiene un solo tipo de antígeno adsorbido en la superficie tridimensional de nitrocelulosa microporosa.

Asegure la corredera en una cámara para facilitar su manejo durante los pasos posteriores. Agregue un tampón de bloqueo que contenga proteínas que se unan a las superficies restantes del portaobjetos para evitar la unión inespecífica de anticuerpos a la superficie.

Incube el portaobjetos de microarrays con suero humano diluido. Los isotipos de anticuerpos en el suero, específicos para los antígenos en el portaobjetos, reconocen y se unen a los epítopos de los antígenos.

Retire el suero. Lave con un tampón para eliminar los anticuerpos y las proteínas no unidos en el portaobjetos.

Agregue mezclas de anticuerpos secundarios conjugados con puntos cuánticos, cada uno con un punto cuántico diferente. Los anticuerpos secundarios específicos del isotipo se unen específicamente al respectivo isotipo de anticuerpo sérico unido a los antígenos en el portaobjetos.

Utilice un generador de imágenes de microarrays para cuantificar la unión de anticuerpos a antígenos dentro del portaobjetos de microarrays.

Tras la excitación en longitudes de onda apropiadas, los puntos cuánticos unidos a anticuerpos secundarios vuelven al estado fundamental y emiten señales fluorescentes específicas que son detectadas por el fotodetector.

La intensidad de fluorescencia puntual cuantifica el isotipo de anticuerpo sérico dentro del suero unido al antígeno individual.

Después de programar el software de impresión con el protocolo deseado, inicie la tirada. Cuando haya terminado, coloque los portaobjetos de microarrays sin sondear en una caja a prueba de luz en un gabinete desecador a temperatura ambiente.

Para sondear los sueros en busca de anticuerpos en el microarray, use clips para sujetar los portaobjetos del microarray con la almohadilla hacia arriba en las cámaras de sondeo y coloque las cámaras en los marcos.

Tenga cuidado al ensamblar los portaobjetos, ya que se rompen fácilmente, y verifique si hay fugas después de la rehidratación. Si es necesario, desmonte y vuelva a montar las guías para reparar las fugas.

Rehidratar los portaobjetos con 100 microlitros de tampón de bloqueo filtrado por pocillo y diluir los sueros en una proporción de 1 a 100 en 100 microlitros de tampón de bloqueo por muestra. A continuación, incubar los portaobjetos de microarrays rehidratados y los sueros diluidos durante 30 minutos a temperatura ambiente y de 100 a 250 rotaciones por minuto en un agitador orbital.

Al final de la incubación, utilice puntas de pipeta conectadas a una línea de vacío con un matraz de recogida secundario para aspirar cuidadosamente el tampón de bloqueo de la esquina de cada cámara sin tocar las almohadillas, y añada inmediatamente los sueros diluidos a las almohadillas sin dejar que se sequen. Luego, coloque los marcos cubiertos en bandejas que contengan toallas de papel húmedas selladas para mantener la humedad e incube los marcos durante la noche a 4 grados centígrados en una coctelera mecedora.

Para el etiquetado de anticuerpos secundarios conjugados con puntos cuánticos, aspire cuidadosamente los sueros, como se acaba de demostrar, y enjuague los portaobjetos con tres lavados en 100 microlitros de tampón T-TBS fresco por pocillo durante 5 minutos cada uno en un agitador orbital. Luego, los portaobjetos se incuban con una mezcla de anticuerpos secundarios conjugados con puntos cuánticos y luego se lavan tres veces como se describe en el protocolo utilizando la misma técnica que se acaba de demostrar.

Después del último lavado, retire con cuidado los portaobjetos de las cámaras y enjuague suavemente los portaobjetos con agua doble destilada filtrada, y luego coloque cada portaobjetos en un tubo de 50 mililitros. Luego, seque los portaobjetos por centrifugación.

Para adquirir imágenes de los portaobjetos de microarrays, primero encienda el generador de imágenes portátil y coloque con cuidado el portaobjetos que se va a visualizar boca abajo en el soporte de portaobjetos de la cámara de imágenes. Abra el software de imágenes y, en la pestaña "Configurar generador de imágenes", seleccione la configuración de portaobjetos adecuada.

En la pestaña "Control de imagen", seleccione el canal fluorescente apropiado y ajuste los tiempos de exposición y adquisición, dependiendo de la reactividad de los sueros. Luego, haga clic en 'Capturar' para iniciar la adquisición de imágenes. Al final de la adquisición, use las cuadrículas orientadas en los marcadores fiduciales para detectar los puntos de la matriz.