Microscopía de lámina de luz reticular para visualizar las interacciones receptor-ligando en células vivas

La microscopía de hoja de luz de celosía, LLSM, permite la visualización de las interacciones receptor-ligando de la superficie celular en células vivas con alta resolución espaciotemporal.

Tome un cubreobjetos que contenga células transducidas que expresan ligandos que emiten fluorescencia roja. Coloque el cubreobjetos con la celda hacia arriba en un portamuestras engrasado. Fije el soporte en el piezoeléctrico de una platina de microscopio para permitir un posicionamiento y escaneo precisos de la muestra durante la obtención de imágenes. Ajuste la configuración del software para centrarse en una sola célula que exprese ligando.

Pipetee la suspensión celular que expresa el receptor en el cubreobjetos. Los receptores están marcados con anticuerpos verdes marcados con fluoróforos. Imagen de los pares de celdas que interactúan.

El láser de excitación del microscopio emite un rayo láser circular polarizado linealmente que pasa a través de lentes cilíndricas para crear una lámina de luz. La lámina de luz se proyecta sobre un modulador que elimina el exceso de difracción y lo transforma en un patrón de celosía ultrafino.

La lámina de luz de celosía ilumina una sección ultradelgada del par de células que interactúan, y la fluorescencia emitida por las células que interactúan se captura perpendicularmente al haz incidente. Tome imágenes del par de células que interactúan en múltiples planos Z y capture imágenes bidimensionales en cada plano focal con una cámara de alta velocidad.

Usando el software adecuado, combine estas imágenes para formar una pila z, una imagen cuatridimensional de alta resolución que demuestra la dinámica espaciotemporal de la interacción receptor-ligando de la superficie celular.

Agregue 10 mililitros de agua y 30 microlitros de fluoresceína al baño LLSM. Primero, presione Imagen (Inicio) para mover el objeto a la posición de la imagen y observe un patrón de rayo láser de un solo recipiente.

Alinee el rayo láser usando la guía y la región preestablecida de interés para hacer que el rayo sea un patrón delgado que esté equilibrado en todas las direcciones. El haz también debe aparecer enfocado en la cámara del buscador. Utilice los dos ajustadores de inclinación del espejo, el micrómetro de enfoque superior y el color del objetivo para ajustar el haz.

A continuación, lave el baño y los objetivos con al menos 200 mililitros de agua para eliminar completamente la fluoresceína.

Para obtener imágenes de perlas fluorescentes estándar, active Dither configurando 3 en el cuadro 'X Galvo Range' y presione Live para ver el campo actual. Ajuste manualmente el espejo inclinable, el color del objetivo y el micrómetro de enfoque para obtener los valores de gris más altos. Luego, ajuste según sea necesario para obtener patrones adecuados para los modos de captura de escaneo de objetivos, galvo Z, objetivo Z plus y escaneo de muestras. Después de esto, presione Ejecutar en modo de escaneo de muestra para recopilar la función de dispersión del punto de muestra para la eliminación de sesgo y la desconvolución. Cambie los láseres al modo de tres colores y presione Ejecutar nuevamente.

Para comenzar, agregue 100,000 células presentadoras de antígeno al cubreobjetos circular de 5 milímetros de diámetro preparado y déjelas reposar durante 10 minutos. Engrase el portamuestras y agréguele el cubreobjetos con la celda hacia arriba.

A continuación, agregue una gota de medios de imagen a la parte posterior del cubreobjetos. Atornille el soporte de muestra en el piezoeléctrico y presione Imagen (Inicio). Encuentre una célula presentadora de antígeno para obtener imágenes y asegúrese de que el LLSM y el software de imágenes funcionen correctamente.

Presione En vivo para ver la imagen actual. Muévase a lo largo de Z para encontrar el cubreobjetos y las celdas. Encuentre el centro de una célula presentadora de antígeno moviéndose en la dirección Z, luego, presione Detener para pausar el láser. Marca 3D e ingresa la configuración deseada. Presione Entrar y luego presione Ejecutar para recopilar los datos.

Baje la platina a la posición de carga y agregue 50 microlitros de células T en el medio de imagen gota a gota, directamente sobre el cubreobjetos. Lo mejor es dejar que se forme una gota en el extremo de la punta de la pipeta y luego, tocar la punta con el líquido del baño. Vuelva a subir el escenario haciendo clic en Imagen (Retorno).

Comience a obtener imágenes. Asegúrese de establecer la pila Z y la longitud de lapso de tiempo deseadas. Por ejemplo, obtenga imágenes de 60 pilas Z con un tamaño de paso de 0,4 micrómetros e ingrese marcos de tiempo de 500. Deje de grabar antes de alcanzar los 500 fotogramas para evitar el fotoblanqueo. Utilice el modo En vivo para buscar pares de celdas y, cuando esté listo y se hayan ingresado los ajustes deseados, presione Ejecutar para recopilar datos.