Microscopía de campo oscuro para visualizar la dinámica de difusión de nanorods en la membrana celular

Para investigar la dinámica de difusión de nanovarillas de oro en una membrana de células vivas utilizando microscopía de campo oscuro, DFM, combinado con seguimiento de una sola partícula, comience con un cubreobjetos esterilizado en una placa de cultivo que contenga un medio adecuado. Agregue la suspensión celular al cubreobjetos. El medio facilita el crecimiento celular.

Incubar con nanovarillas de oro cargadas positivamente que se adsorben en la membrana celular cargada negativamente a través de interacciones electrostáticas. Pipetea el medio del plato a la ranura de un portaobjetos de vidrio. Coloque el cubreobjetos con la celda hacia abajo en la ranura y selle.

Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio de campo oscuro. El microscopio ilumina la muestra con una luz oblicua de ángulo alto que pasa a través de un condensador de campo oscuro especializado.

Tras la iluminación de las nanovarillas, los electrones libres en la superficie de las nanovarillas oscilan a una frecuencia resonante con la luz incidente. Los electrones oscilantes dispersan la luz en una longitud de onda específica capturada por la lente del objetivo, lo que permite la visualización de nanorods.

Del mismo modo, la membrana celular, compuesta de lípidos y proteínas, dispersa la luz incidente a un índice de refracción más alto que el medio circundante, creando una imagen brillante sobre un fondo oscuro. Capture imágenes DFM de series temporales.

Utilizando un software adecuado, realice un análisis de seguimiento de una sola partícula en las imágenes DFM para visualizar la difusión de las nanovarillas a través de la membrana celular con alta resolución espaciotemporal.

Comience quemando un cubreobjetos de vidrio bañado en etanol sobre la llama y colocando el cubreobjetos en un recipiente de cultivo celular de 35 por 10 milímetros que contenga 2 mililitros de medio de cultivo celular sin rojo de fenol. Agregue 50 microlitros de la suspensión celular de interés en el cubreobjetos y agite suavemente el plato hacia adelante y hacia atrás y hacia la izquierda y hacia la derecha para distribuir uniformemente las células.

Coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante aproximadamente 12 horas hasta que las células alcancen una confluencia del 20% al 40% antes de agregar 20 microlitros de nanovarillas de oro recubiertas de CTAB a la placa. Después de agitar suavemente para dispersar las nanovarillas uniformemente por el plato, colóquelo en una atmósfera humidificada durante 5 minutos.

Al final de la incubación, transfiera lentamente 100 microlitros de sobrenadante del plato a la ranura de un portaobjetos de vidrio y coloque con cuidado el cubreobjetos con la celda hacia abajo en la ranura del portaobjetos. Luego, selle el borde del cubreobjetos con esmalte de uñas y deje que el esmalte de uñas se seque antes de colocar el portaobjetos en la platina del microscopio de campo oscuro.

Para el seguimiento de una sola partícula mediante microscopía de campo oscuro, coloque una gota de aceite en el condensador de campo oscuro sumergido en aceite y gire la perilla hasta que el condensador entre en contacto con el portaobjetos de vidrio. Coloque una gota de aceite en la parte superior del cubreobjetos y gire la perilla de enfoque hasta que el objetivo de inmersión en aceite de 60x toque el aceite.

Encienda la fuente de luz y gire ligeramente la perilla de enfoque para enfocar el plano de imagen. A continuación, haga clic en el icono de la cámara en el software del microscopio para registrar una serie temporal de imágenes de luz de dispersión de muestra utilizando la cámara CMOS en color y guarde la imagen en formato TIFF.

Para extraer una sola trayectoria a largo plazo, abra la imagen en ImageJ y haga clic en Imagen | Tipo | y 8 bits para convertir la imagen del modo RGB al modo de 8 bits. Para ajustar el contraste, haga clic en Imagen | Ajustar | Brillo | Contraste y defina los parámetros. Selecciona una partícula objetivo y usa "Control + X" para cortar el fondo de la serie temporal.

Haga clic en Plug-ins | Particle Tracker Classic | y Particle Tracker para abrir la ventana de detección de partículas y vincular partículas y establecer el radio en 6, el límite en 0 y el percentil en 0,01%. Establezca el rango de enlaces en 10 y el desplazamiento en 10, y haga clic en "Aceptar" para abrir la ventana de resultados del rastreador de partículas para ver los resultados.

Haga clic en "Visualizar todas las trayectorias" para inspeccionar las trayectorias generadas. Si la trayectoria generada por software y la trayectoria móvil de las nanovarillas de oro coinciden, haga clic en "Guardar informe completo" para guardar los resultados. Si la trayectoria generada por software no coincide con la trayectoria de movimiento de las nanovarillas de oro, haga clic en "Volver a vincular partículas" para volver a vincular las partículas detectadas con diferentes rangos de enlace y parámetros de percentil.