¿Por qué es importante medir la cinética de desenrollamiento del ADN para la validación del blanco?

La medición de la cinética de desenrollamiento del ADN proporciona una lectura funcional directa de la estabilidad del nucleosoma, lo que permite la evaluación cuantitativa del compromiso con dianas epigenéticas. Esta medición apoya la validación de dianas al vincular cambios biofísicos con resultados transcripcionales en sistemas relevantes para la enfermedad. Los datos cinéticos permiten la reducción mecanicista de riesgos al aclarar cómo los compuestos influyen en la accesibilidad de la cromatina a lo largo del tiempo.

¿Cómo encaja el aislamiento del nucleosoma como variable independiente en la secuencia de descubrimiento?

Aislar nucleosomas sobre un sustrato de mica funcionalizado permite la observación controlada del desenrollamiento del ADN sin factores celulares que interfieran. Este enfoque reduccionista se adapta al descubrimiento temprano al proporcionar un sistema definido para evaluar los efectos de compuestos sobre mecanismos centrales de la cromatina. El sistema aislado facilita el desarrollo de ensayos al ofrecer resultados cuantitativos y reproducibles para campañas de cribado.

¿Qué mediciones cuantitativas de la variable dependiente permiten la identificación del compuesto activo?

Las mediciones temporales de la altura del nucleosoma sirven como variable dependiente para cuantificar los eventos y la cinética del desenrollamiento del ADN. Estas mediciones permiten la identificación de compuestos activos al posibilitar la comparación directa de los efectos de los compuestos sobre la estabilidad y la dinámica del nucleosoma. Los resultados cuantitativos apoyan el análisis de la relación estructura-actividad al correlacionar modificaciones químicas con cambios en el comportamiento de la cromatina.

¿Por qué son importantes los requisitos de replicación para la colaboración entre funciones?

Los requisitos de replicación garantizan condiciones consistentes de inmovilización de nucleosomas y de imágenes en los experimentos, lo cual es esencial para compartir datos de forma confiable entre equipos. Los protocolos estandarizados para la funcionalización de la mica y el intercambio de tampón permiten obtener resultados reproducibles que apoyan los esfuerzos colaborativos de validación de dianas. La replicación constante reduce la variabilidad en las mediciones cinéticas, mejorando la confianza en la interpretación de datos entre proyectos.

¿Qué capacidades de análisis estadístico se requieren antes de la implementación?

La implementación requiere capacidades para el análisis cinético de datos de intervalos de tiempo, incluyendo la detección de eventos y la determinación de constantes de velocidad a partir de trayectorias de altura de nucleosomas. Se necesitan herramientas estadísticas para cuantificar frecuencias de desenrollamiento, tiempos de permanencia y tasas de transición entre estados enrollados y desenrollados. Estas capacidades de análisis permiten a los equipos comparar condiciones y evaluar los efectos de compuestos con el rigor adecuado para la toma de decisiones.

Microscopía de fuerza atómica time-lapse de alta velocidad para capturar la dinámica de los nucleosomas

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas biológicas

0 vistas • 4:56 min • July 8th, 2025

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Los nucleosomas, unidades repetidas de ADN eucariotas, consisten en segmentos de ADN envueltos alrededor de núcleos de proteínas histonas. El ADN que se desenvuelve alrededor del núcleo de histonas es crucial para la dinámica de los nucleosomas.

Para capturar la dinámica de los nucleosomas, comience con un sustrato de mica liso y funcionalizado montado en una etapa de escáner de microscopio de fuerza atómica, AFM. Cubra el sustrato con un tampón que contenga nucleosomas.

El ADN del nucleosoma cargado negativamente interactúa con las cargas positivas en la mica funcionalizada, inmovilizándola en la superficie. Lave el sustrato de mica inmovilizado con un tampón para evitar el hacinamiento de los nucleosomas.

Transfiera la etapa del escáner que contiene nucleosomas a una cámara de imágenes que contenga un voladizo premontado, con una punta en el borde y mirando hacia arriba hacia los nucleosomas.

Llene la cámara con un tampón de imágenes. Alinee el rayo láser en la parte posterior del voladizo para garantizar mediciones precisas de deflexión.

La punta de AFM oscila cerca de los nucleosomas completamente envueltos y escanea la superficie para medir la altura de los nucleosomas a intervalos regulares.

El desenvoltorio espontáneo del ADN aumenta la altura del nucleosoma, alternando las oscilaciones de la punta y provocando una desviación en voladizo. Esta desviación en voladizo cambia la posición del rayo láser reflejado, que es detectado por un detector sensible a la posición y produce imágenes topográficas de nucleosomas.

En las imágenes de AFM, el núcleo de histonas aparece como una mancha brillante con ADN sin envolver de alturas crecientes con el tiempo, indicativo de la dinámica de los nucleosomas.

Use pegamento de escáner de varilla de vidrio para unir una varilla de vidrio a la platina del escáner AFM. Deje que se seque durante un mínimo de 10 minutos. Mientras tanto, haga piezas circulares de mica de 0,1 milímetros de grosor con un diámetro de 1,5 milímetros perforándolas con una hoja de mica más grande. Use el pegamento para varillas de vidrio de mica AFM de alta velocidad para unir esta pieza de mica a la varilla de vidrio en el AFM de alta velocidad y déjela intacta durante un mínimo de 10 minutos mientras se seca.

Luego, corte las capas de la mica con una cinta sensible a la presión hasta que se vea una capa bien cortada en la cinta. A continuación, diluya 1 microlitro de caldo de APS de 50 milimolares en 99 microlitros de agua desionizada destilada para hacer una solución de APS de 500 micromolares. Deposite 2,5 microlitros de la solución sobre la superficie de mica recién cortada y deje que la superficie se funcionalice durante 30 minutos.

Después de la incubación, enjuague la mica varias veces con agua destilada desionizada aplicando enjuagues de 3 microlitros. Elimine el agua por completo después de cada enjuague colocando una toallita no tejida en el borde de la mica. Después del enjuague final, coloque 3 microlitros de agua desionizada destilada en la superficie y déjela reposar durante un mínimo de 5 minutos para eliminar cualquier APS no unido específicamente.

A continuación, coloque la sonda en el soporte de AFM de alta velocidad y colóquelo en la platina de AFM con la punta hacia arriba. Enjuague el soporte con 100 microlitros de agua desionizada destilada, seguido de dos enjuagues de 100 microlitros de tampón de imágenes de nucleosomas filtrado de 0,22 micras. Con los enjuagues hechos, llene la cámara con 100 microlitros de tampón de imágenes de nucleosomas, sumergiendo la punta.

Ajuste la posición del voladizo hasta que sea golpeado con el láser. Luego, enjuague la mica APS cinco veces con tampón de imágenes de nucleosomas filtrado, usando 4 microlitros por enjuague. Diluya 1 microlitro del material de ensamblaje del nucleosoma en 250 microlitros de tampón filtrado de imágenes de nucleosomas para obtener una concentración final de nucleosoma de 1 nanomolar.

Deposite 2,5 microlitros de esta dilución en la superficie y déjela reposar durante 2 minutos. Enjuague la superficie dos veces con 4 microlitros de tampón de imágenes de nucleosomas para evitar el hacinamiento. Después del enjuague final, deje la superficie cubierta con tampón de imágenes. Coloque el escáner y la muestra en la parte superior del soporte de la punta para que la muestra quede boca abajo.

Para comenzar la aproximación, utilice la función de aproximación automática con una amplitud de punto de ajuste cercana a la amplitud de oscilación libre. Ajuste el punto de ajuste hasta que la superficie esté bien rastreada. Luego, establezca el área de la imagen alrededor de 150 por 150 nanómetros a 200 por 200 nanómetros con una velocidad de adquisición de datos de alrededor de 300 milisegundos por cuadro de imagen.