Microscopía electrónica de transmisión para cuantificar la distribución de glucógeno en músculos esqueléticos humanos

El glucógeno, un polímero de glucosa ramificado, es una reserva de energía en los compartimentos intermiofibrilares, intramiofibrilares y subsarcolémicas subcelulares dentro del músculo esquelético humano.

Para cuantificar la distribución de glucógeno subcelular mediante microscopía electrónica de transmisión, TEM, obtener tejido muscular esquelético humano aislado. Fijar con glutaraldehído para preservar la estructura del tejido. Coloque el tejido en una solución de tetróxido de osmio y ferrocianuro de potasio.

El complejo reducido de osmio-ferrocianuro se une a los grupos hidroxilo en el glucógeno, mejorando el contraste de las partículas de glucógeno en el músculo. Además, las membranas y el retículo sarcoplásmico, un orgánulo unido a la membrana, se tiñen.

Deshidratar el tejido en concentraciones crecientes de etanol. Incrustar en resina, formando un bloque sólido. Obtenga secciones ultrafinas con fibras musculares orientadas longitudinalmente; transferir a rejillas TEM.

Sumerja las rejillas en acetato de uranilo, solución de metales pesados. Los iones de uranilo se unen a lípidos y proteínas cargados negativamente, lo que los hace densos en electrones. Manchar con solución de citrato de plomo.

Los iones de plomo se unen a las regiones teñidas de osmio, incluidas las partículas de glucógeno, lo que mejora el contraste. También se unen a las regiones que reaccionan con acetato de uranilo, intensificando la opacidad de los electrones.

Durante las imágenes TEM, a medida que los haces de electrones atraviesan el tejido, las regiones densas en electrones teñidas, incluido el glucógeno, dispersan más electrones, mientras que las regiones no teñidas transmiten electrones.

En la imagen TEM de alto contraste producida, las partículas de glucógeno aparecen distintas y oscuras; las regiones no teñidas aparecen más claras, lo que facilita la visualización y cuantificación de la distribución de glucógeno subcelular en el músculo.

Aísle una pequeña muestra de la biopsia muscular o del músculo completo, que tenga un diámetro máximo de 1 milímetro en cualquier dirección y sea más larga longitudinalmente que transversalmente.

Coloque la muestra en el tubo que contiene la solución de fijación primaria fría. Guárdelo a 5 grados centígrados durante 24 horas. Luego, lave la muestra 4 veces en tampón de cacodilato de sodio molar 0.1. Con pipetas de transferencia, retire el tampón usado del tubo, dejando la muestra intacta, y agregue el tampón nuevo. Fije posteriormente la muestra con tetróxido de osmio al 1% y ferrocianuro de potasio al 1,5% en tampón de cacodilato de sodio molar al 0,1 durante 120 minutos a 4 grados centígrados.

Enjuague la muestra dos veces en agua doble destilada a temperatura ambiente. Deshidratar sumergiendo en una serie graduada de etanol a temperatura ambiente. Infiltrar la muestra con óxido de propileno y mezclas graduadas con resina epossídica a temperatura ambiente utilizando las proporciones de volumen mencionadas.

Al día siguiente, incruste las muestras en resina epossídica 100% fresca en moldes y polimerice a 60 grados centígrados durante 48 horas.

Monte el bloque de una muestra en el soporte para ultramicrotomos. Recorta el bloque en la superficie con una cuchilla de afeitar para alcanzar el nivel del tejido. Monte una cuchilla de diamante delante de la muestra y alinee la superficie de la muestra paralela a la cuchilla.

Produzca una sección semidelgada de 1 micrómetro de espesor con la cuchilla de diamante para verificar la orientación de la muestra. Tiña la sección semidelgada con azul de toluidina para su observación con microscopía óptica. Luego, recorte aún más el bloque para reducir el área de interés y obtener secciones ultradelgadas adecuadas.

Corte secciones ultrafinas de 60 a 70 nanómetros de espesor con un segundo cuchillo de diamante. Reúna de 1 a 2 secciones en rejillas de cobre de un orificio usando un Perfect Loop. Para contrastar las secciones, sumerja las rejillas en una solución de acetato de uranilo durante 20 minutos, lave las rejillas en agua bidestilada, y luego, sumerja las rejillas en citrato de plomo durante 15 minutos y vuelva a lavar las rejillas en agua bidestilada.

Encienda el microscopio electrónico de transmisión, la computadora y el software de grabación de imágenes. Grabe imágenes digitales con una cámara CCD digital de barrido lento y el software de imágenes asociado. Después de insertar la rejilla con varias secciones en la platina del microscopio, examine la rejilla inicialmente con bajo aumento para elegir las secciones de mejor calidad y determinar la dirección de las fibras musculares.

A continuación, enfoque la imagen con un aumento superior a 30.000, con el haz centrado en una fibra periférica en la sección, y grabe imágenes con un tiempo de exposición de 1 segundo con el aumento deseado. Asegúrese de que las imágenes se distribuyan a lo largo y ancho de la fibra en un orden aleatorio pero sistemático para obtener resultados imparciales, y repita las imágenes hasta que se obtengan imágenes de 6 a 10 fibras.

Importe imágenes a imageJ haciendo clic en Archivo, seguido de Abrir. Establezca la escala global para que coincida con el tamaño original de la imagen haciendo clic en Analizar y, a continuación, en Establecer escala. Para acercar el 100%, haga clic en Imagen, vaya a Zoom y haga clic en Entrar.

Mida el grosor de un disco Z por imagen del espacio miofibrilar, usando la herramienta Línea recta del menú Herramientas, y calcule el grosor promedio del disco Z de cada una de las 6 a 10 fibras. Utilice la herramienta Línea segmentada para medir la longitud de la miofibrilla más externa, visible justo debajo de la región subsarcolémica.

Para insertar una cuadrícula, haga clic en Analizar, seleccione Herramientas y, a continuación, seleccione Cuadrícula. Ahora establezca el área por punto en 32,400 nanómetros cuadrados. Cuente el número de aciertos dentro de la longitud disponible, en las 12 imágenes subsarcólemas donde una cruz golpea el glucógeno subsarcólema.

Inserte una cuadrícula haciendo clic en Analizar, luego, seleccione Herramientas, seguido de Cuadrícula, y establezca el Área por punto en 160,000 nanómetros cuadrados. Cuente el número de aciertos en las 12 imágenes miofibrilares, donde una cruz golpea el espacio intramiofibrilar.

Por otra parte, para insertar una cuadrícula, haga clic en Analizar, seleccione Herramientas y, luego, seleccione Cuadrícula. Ahora, establezca el área por punto en 3.600 nanómetros cuadrados. Cuente el número de aciertos en las 12 imágenes miofibrilares donde una cruz golpea el glucógeno intramiofibrilar.

Inserte una cuadrícula haciendo clic en Analizar, luego, seleccione Herramientas, seguido de Cuadrícula, y establezca el Área por punto en 32,400 nanómetros cuadrados. Cuente el número de aciertos en las 12 imágenes miofibrilares donde una cruz golpea el glucógeno intermiofibrilar.

Usando la cuadrícula de 32,400 nanómetros cuadrados para elegir aleatoriamente las partículas de glucógeno, comience con el cuadrado superior izquierdo y muévase hacia la izquierda si es necesario. Con la herramienta Línea recta, mida el diámetro de 5 partículas de glucógeno elegidas al azar de cada piscina para cada una de las 12 imágenes para obtener un promedio de 60 partículas por piscina por fibra.