Microscopía de inmunofluorescencia para el análisis de roturas de doble cadena de ADN

Para visualizar proteínas específicas de respuesta al daño del ADN en la rotura de doble hebra de ADN, DSB, sitios utilizando microscopía de inmunofluorescencia, comience con portaobjetos de microscopio que contengan monocapas de células mononucleares humanas con DSB. Fije las células con paraformaldehído.

Tratar con un detergente no iónico, permeabilizando las membranas para acceder a las dianas intracelulares. Agregue una solución de bloqueo que contenga proteínas, bloqueando los sitios de unión no específicos de las células. Incubar con anticuerpos primarios que se unen a las proteínas de respuesta diana.

Tratar con una mezcla de anticuerpos secundarios marcada con diferentes fluoróforos para unirse específicamente a sus respectivos anticuerpos primarios unidos a las proteínas. Tríbase el ADN con DAPI. Agregue medio de montaje; Monte el cubreobjetos.

Durante la microscopía de fluorescencia, el haz de luz incidente llega al filtro de excitación permitiendo el paso de la luz de una longitud de onda de excitación específica. Al llegar al espejo dicroico, un divisor de haz, la luz de excitación se refleja selectivamente hacia la lente del objetivo, que enfoca la luz en la muestra.

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