Name: PCR optimizado basado en la detección de Mycoplasma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Aprende a detectar Mycoplasma en cultivos celulares mediante PCR optimizado con el kit LookOut. Este método incluye preparación de muestras, amplificación y electroforesis en gel para resultados confiables.

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Financiado por Sigma-Aldrich

1. Detección de Mycoplasma <ol><li> Sobrenadantes de cultivo celular se puede probar directamente, o la muestra se puede preparar para su uso en una fecha posterior. Para prepararse para su uso posterior a cabo 100 l de sobrenadante en un tubo estéril de amplificación y se incuba a 95 ° C durante 5 minutos. Una vez que se completa la muestra se puede almacenar a 2-8 º C durante un máximo de una semana. Justo antes de ejecutar el centrifugar brevemente muestra (5 segundos) para sedimentar los restos celulares. </li><li> Para preparar las muestras para PCR, determinar el volumen total de ADN Taq polimerasa Jumpstart / rehidratación búfer necesario para las reacciones. Vamos a preparar cinco reacciones total. Cinco reacciones requerirá 2.5μl de Taq y 114.5μl de tampón de rehidratación. Este contendrá un mínimo de una unidad de Taq por reacción y 22.5μl de tampón de rehidratación por reacción de la muestra y el control negativo más 24.5μl de rehidratación de amortiguación para el control positivo. 1 unidad de ADN polimerasa por reacción, debe añadirse a la cantidad adecuada de tampón de rehidratación. Esto va a variar con la Taq utilizado. </li><li> Coloque el volumen calculado de la ADN polimerasa Taq en un tubo de microcentrífuga limpio y seguir con el volumen calculado de tampón de rehidratación. La ADN polimerasa / rehidratación buffer se debe mezclar suavemente agitando el tubo. Esta mezcla no debe ser vortex. </li><li> Para preparar el control negativo y las muestras de uso de los tubos de reacción transparente en el kit. Los tubos de reacción en el kit ya contienen la nuclueotides, cebadores y el ADN de control interno. 23 l de mezcla de Jumpstart Taq ADN polimerasa buffer / rehidratación, como se prepara en los pasos anteriores, debe ser colocado en cada uno de los controles negativos y los tubos de muestra. Añadir 2 l de agua libre de ADN con el control negativo y añadir 2 l de la muestra a cada uno de los tubos de muestra y la etiqueta. Mezclar el contenido de revoloteo de los tubos. Contenido no debe ser vortex. </li><li> Para preparar el control positivo utilizar los tubos de reacción de color rosa en el kit. Los tubos de reacción en el kit ya contienen la nuclueotides, cebadores y el ADN de control interno. Añadir 25 l de mezcla de Jumpstart Taq ADN polimerasa buffer / rehidratación, como se prepara en los pasos anteriores, para los tubos de reacción y la etiqueta. Mezclar el contenido de revoloteo de los tubos. Contenido no debe ser vortex. Incubar el control negativo, control positivo y los tubos de la muestra a temperatura ambiente durante 5 minutos. </li><li> Para el PCR a tener lugar las muestras deben ser colocadas en un termociclador. Al utilizar JumpStart Taq un paso de activación no es necesaria. Coloque los tubos de reacción en el termociclador. Los ciclos deben establecerse de la siguiente manera: 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 40 segundos. Estos ciclos se ejecutará 40 veces. </li><li> Una vez que los ciclos de PCR se han completado las muestras deben ser enfriados hasta 4.8 ° C por dejarlas fuera del termociclador y colocarlos en hielo. Cuando se hayan enfriado las muestras que serán cargados en el gel de agarosa para electroforesis. De carga de gel y colorantes no son necesarios puesto que ya están presentes en los tubos de reacción. Directamente carga de 8 l para cada PCR en un carril separado. Detener la electroforesis después de la migración de 2,5 a 3,0 cm. </li></ol> 2. Resultados representante El control negativo debe mostrar una banda de aproximadamente 481 pb. Esto se puede ver en la columna de control negativo en la electroforesis en gel que se muestra al principio del vídeo. La ausencia de la banda de control negativo en 481 puntos básicos es un buen indicador de que la actividad de la polimerasa no se sufficienttaq utilizado no fue lo suficientemente sensible. Mycoplasma muestras positivas se muestran las bandas en el rango de 270 ± 8 pb. La banda será pesada para muestras muy contaminadas y débiles de las muestras ligeramente contaminados. Las variaciones en la intensidad se puede ver en las columnas muestra positiva en la electroforesis en gel que se muestra al principio del vídeo. Todas las muestras contienen un control interno negativo para demostrar que el PCR dio como se esperaba. Es normal que la ausencia del control interno en muestras muy contaminadas. Si no hay una banda en el rango positivo o una banda en el rango negativo en la muestra de esto es un buen indicador de que sus muestras están inhibidos. Si la muestra se inhibe los inhibidores de la PCR se pueden eliminar mediante la realización de una extracción de ADN. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3057/3057fig1.jpg"> Las bandas de la figura 1 amplicón relevantes:. Resultados de la detección de micoplasmas por PCR se muestran. El carril 2 es el control negativo, que debe mostrar una banda de aproximadamente 481 pb. La ausencia de la banda de control negativo en 481 puntos básicos es un buen indicador de que el utilizado taq no era lo suficientemente sensible. Mycoplasma muestras positivas se muestran las bandas en el rango de 270 + 8 pb, como se muestra en los carriles de 3 a 6. La banda se heavy para muestras muy contaminadas (calle 6) y débil para las muestras ligeramente contaminados (calle 4). Todas las muestras contienen un control interno negativo (481 pb) para demostrar que el PCR dio como se esperaba. Es normal que la ausencia del control interno en muestras muy contaminadas.

<ol><li>Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+Sensitivity+of+Polymerase+Chain+Reaction+%28PCR%29+in+Comparison+with+Other+Methods+for+the+Detection+of+Mycoplasma+Contamination+in+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines.</a> Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).</li>
<li>Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+Cell+Culture+Enrichment+for+Improving+the+Sensitivity+of+Mycoplasma+Detection+Methods+Based+on+Nucleic+Acid+Amplification+Technology+%28NAT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).</li>
<li>Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+Testing+of+Cell+Substrates+and+Biologics%3A+Review+of+Alternative+Non-Microbiological+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2011).</li>
</ol>

Los autores son empleados de Sigma-Aldrich que producen los reactivos y las herramientas utilizadas en este artículo.

Debido a la extrema sensibilidad de los kit, cuando se realiza correctamente el equipo debe dar resultados precisos que indica si la muestra tiene la contaminación por micoplasma. El kit ha sido optimizado para su uso con la polimerasa de ADN Taq JumpStart. Taqs se pueden usar otros en la preparación de las muestras, pero la banda de control interno en 481 pb, deben estar presentes para indicar la sensibilidad de la alternativa correcta taq. Es posible que las bandas positivas para exponer diferentes densidades en función del nivel de contaminación. Es posible observar la ausencia de la banda de control interno en muestras muy contaminadas. Precaución y utilizando la técnica adecuada en la preparación de las muestras para evitar la contaminación son fundamentales para la correcta. detección cuando se utiliza el kit de detección de Mycoplasma LookOut PCR.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MP0035 </td><td> </td></tr><tr><td> JumpStart Taq ADN polimerasa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9307 </td><td> </td></tr><tr><td> Genómica GenElute sangre de ADN kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MP0030 </td><td> </td></tr><tr><td> Tubos Nunc amplificación </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0447 </td><td> </td></tr></tbody></table>

pcr optimizado basado en la detección de mycoplasma

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

El mantenimiento de líneas celulares libres de contaminación es esencial para la investigación celular. Entre las mayores preocupaciones de los contaminantes son la contaminación por micoplasma. A pesar de micoplasma no suelen matar a las células contaminadas, son difíciles de detectar y pueden causar una variedad de efectos sobre las células cultivadas, incluyendo la alteración del metabolismo, se redujo la proliferación y aberraciones cromosómicas. En resumen, la contaminación por micoplasma compromete el valor de las líneas celulares de proporcionar información rigurosa para la investigación en ciencias biológicas. Las fuentes de contaminación por micoplasma en el laboratorio son muy difíciles de controlar por completo. Como ciertas especies de micoplasmas se encuentran en la piel humana, pueden ser introducidos a través de una técnica aséptica pobres. Además, pueden provenir de los suplementos contaminados, tales como el suero bovino fetal, y lo más importante de otros cultivos de células contaminadas. Una vez micoplasmas contaminantes de una cultura, que pueden propagarse rápidamente a contaminar otras áreas del laboratorio. Estricto cumplimiento de buenas prácticas de laboratorio, tales como una buena técnica aséptica son fundamentales, y las pruebas de rutina para micoplasma es muy recomendable para el éxito del control de la contaminación por micoplasma. PCR basado en la detección de micoplasma se ha convertido en un método muy popular para el mantenimiento rutinario línea celular. Métodos basados ​​en PCR de detección son muy sensibles y pueden dar resultados rápidos, lo que permite a los investigadores para responder rápidamente a aislar y eliminar la contaminación una vez que se detecta en comparación con el tiempo necesario utilizar las técnicas microbiológicas. El kit de detección de Mycoplasma LookOut PCR es muy sensible, con un límite de detección de sólo dos genomas por microlitro. Tomando ventaja de la polimerasa de ADN altamente específicas JumpStart Taq y un primer diseño patentado, los falsos positivos se reducen considerablemente. El práctico formato de 8 tubos, tiras pre-recubiertos con dNTPs, primers y asociados ayuda a aumentar el rendimiento para satisfacer las necesidades de los clientes con grandes colecciones de líneas celulares. Dada la extrema sensibilidad del kit, el gran cuidado se debe tomar para prevenir la contaminación accidental de las muestras y reactivos. El protocolo de paso a paso se demuestra destaca las precauciones y prácticas necesarias para la detección de micoplasma fiable. También mostrar y discutir los resultados típicos y su interpretación. Nuestro objetivo es asegurar el éxito de los investigadores que utilizan el kit de detección de Mycoplasma LookOut PCR.

El kit de detección de Mycoplasma LookOut PCR utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que se ha establecido como el método de elección para la mayor sensibilidad en la detección de contaminación por Mycoplasma, Acholeplasma y Ureaplasma en cultivos celulares y cultivo celular otros derivados biológicos.

PCR optimizado basado en la detección de Mycoplasma

El mantenimiento de líneas celulares libres de contaminación es esencial para la investigación basada en células. Entre las mayores preocupaciones en cuanto a contaminantes se encuentra la contaminación por mycoplasma. ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar visualmente los pasos para utilizar el kit de detección PCR de micoplasma lookout, optimizado para detectar contaminación por micoplasma. Esto se logra primero calentando las muestras a 95 grados Celsius para inactivar cualquier molécula de ADN que pudiera hacer que la plantilla deseada no sea adecuada para la PCR. A continuación, prepare las muestras para la PCR utilizando los tubos proporcionados, que ya vienen codificados con nucleótidos, cebadores y ADN de control interno.El tercer paso del procedimiento consiste en el ciclado térmico bajo condiciones cuidadosamente optimizadas para lograr la mayor sensibilidad y eliminar la amplificación no específica. Finalmente, se pueden obtener resultados para determinar si las muestras en cuestión están contaminadas con micoplasma mediante la evaluación por electroforesis en gel de agarosa. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que los reactivos son preacuáticos y los tubos de PCR de alta calidad.Esto lo hace más conveniente y eficiente. Otra ventaja de este kit es que requiere menos de dos genomas de micoplasma por microlitro de muestra para detectar la contaminación. Al realizar el procedimiento de detección de micoplasma, es importante evitar cualquier posible contaminación utilizando equipo de protección personal adecuado para minimizar la exposición de la piel, asegurarse de que todos los reactivos utilizados estén libres de contaminación y mantener en todo momento una técnica aséptica adecuada.El procedimiento puede realizarse directamente sobre sobrenadantes de cultivo celular o bien se pueden preparar muestras para su uso en una fecha posterior. Para preparar las muestras para uso posterior, coloque 100 microlitros de cada sobrenadante en un tubo de amplificación estéril e incube a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Después de la incubación, las muestras pueden almacenarse entre dos y ocho grados Celsius durante hasta una semana.Inmediatamente antes de analizar las muestras, centrifugar brevemente para sedimentar cualquier detrito celular. Para preparar las muestras para la PCR, primero determinar el volumen total necesario del tampón de rehidratación de la ADN polimerasa para las reacciones. Se debe añadir una unidad de ADN polimerasa por reacción al volumen apropiado de tampón de rehidratación, el cual variará según el tac utilizado; en esta demostración se utilizará el jumpstart TAC D 93 0 7 en cinco reacciones, tres muestras más un control positivo y un control negativo.Coloque el volumen calculado de polimerasa de ADN en un tubo limpio para microcentrífuga y añada a continuación el volumen calculado de tampón de rehidratación. Mezcle suavemente el tampón de rehidratación de la polimerasa de ADN golpeando ligeramente el tubo. No vortex esta mezcla.Utilice los tubos de reacción transparentes proporcionados en el kit para preparar el control negativo y las muestras. Estos tubos de reacción ya contienen los nucleótidos, los cebadores y el ADN del control interno; pipete 23 microlitros del tampón de rehidratación de la ADN polimerasa previamente preparado. Mezcle en cada uno de los tubos del control negativo y de las muestras.Luego, agregue dos microlitros de agua libre de ADN al control negativo y dos microlitros de cada muestra a los tubos respectivos. Mezcle el contenido agitando ligeramente los tubos. No vortexe los contenidos.Para preparar el control positivo, utilice los tubos de reacción rosados proporcionados en el kit. Estos tubos de reacción ya contienen los nucleótidos, cebadores y ADN del control interno; añada 25 microlitros de la mezcla tampón de rehidratación de la ADN polimerasa al tubo de reacción. Mezcle el contenido agitando suavemente el tubo; no debe usar el vórtex.Luego, incubar los tubos de control positivo, control negativo y las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de cinco minutos, transferir todos los tubos de reacción a un termociclador. Para la PCR, establecer las siguientes condiciones durante 40 ciclos.94 grados Celsius durante 30 segundos. 55 grados Celsius durante 30 segundos y 72 grados Celsius durante 40 segundos. No se requiere un paso de activación al usar Jumpstart tack.Una vez finalizados los ciclos de PCR, retire las muestras del termociclador y colóquelas en hielo para enfriarlas a entre cuatro y ocho grados Celsius. Luego, las muestras pueden cargarse directamente en un gel de agarosa para electroforesis: cargue ocho microlitros de cada reacción de PCR en un carril separado. No es necesario agregar tampón ni colorante antes de cargar las muestras, ya que estos componentes ya están incluidos en los tubos de reacción.Detenga la electroforesis después de que el colorante marcador haya migrado de 2,5 a tres centímetros. En esta imagen de una banda de gel aros se muestran resultados representativos de la detección de micoplasma mediante PCR. La muestra 2 es el control negativo, que debe mostrar una banda a aproximadamente 481 pares de bases.La ausencia de la banda del control negativo a 481 pares de bases es un buen indicador de que la TAC utilizada no fue lo suficientemente sensible. Las muestras positivas para micoplasma mostrarán bandas en el rango de 270 ± 8 pares de bases, como se observa en las carreras tres a seis. La banda será intensa en muestras altamente contaminadas y débil en muestras ligeramente contaminadas.Todas las muestras contienen un control negativo interno para demostrar que la PCR ocurrió como se esperaba. Es normal observar la ausencia del control interno en muestras altamente contaminadas. La ausencia de una banda tanto en el rango positivo como en el negativo, como se muestra en la banda siete, es un buen indicador de que las muestras están inhibidas.Si la muestra está inhibida, los inhibidores de la PCR se pueden eliminar realizando una extracción de ADN. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar todos los pasos necesarios descritos en el procedimiento del kit, así como de interpretar los resultados y solucionar problemas cuando sea necesario.

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