PCR optimizado basado en la detección de Mycoplasma

El objetivo general de este procedimiento es demostrar visualmente los pasos para utilizar el kit de detección PCR de micoplasma lookout, optimizado para detectar contaminación por micoplasma. Esto se logra primero calentando las muestras a 95 grados Celsius para inactivar cualquier molécula de ADN que pudiera hacer que la plantilla deseada no sea adecuada para la PCR. A continuación, prepare las muestras para la PCR utilizando los tubos proporcionados, que ya vienen codificados con nucleótidos, cebadores y ADN de control interno.

El tercer paso del procedimiento consiste en el ciclado térmico bajo condiciones cuidadosamente optimizadas para lograr la mayor sensibilidad y eliminar la amplificación no específica. Finalmente, se pueden obtener resultados para determinar si las muestras en cuestión están contaminadas con micoplasma mediante la evaluación por electroforesis en gel de agarosa. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que los reactivos son preacuáticos y los tubos de PCR de alta calidad.

Esto lo hace más conveniente y eficiente. Otra ventaja de este kit es que requiere menos de dos genomas de micoplasma por microlitro de muestra para detectar la contaminación. Al realizar el procedimiento de detección de micoplasma, es importante evitar cualquier posible contaminación utilizando equipo de protección personal adecuado para minimizar la exposición de la piel, asegurarse de que todos los reactivos utilizados estén libres de contaminación y mantener en todo momento una técnica aséptica adecuada.

El procedimiento puede realizarse directamente sobre sobrenadantes de cultivo celular o bien se pueden preparar muestras para su uso en una fecha posterior. Para preparar las muestras para uso posterior, coloque 100 microlitros de cada sobrenadante en un tubo de amplificación estéril e incube a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Después de la incubación, las muestras pueden almacenarse entre dos y ocho grados Celsius durante hasta una semana.

Inmediatamente antes de analizar las muestras, centrifugar brevemente para sedimentar cualquier detrito celular. Para preparar las muestras para la PCR, primero determinar el volumen total necesario del tampón de rehidratación de la ADN polimerasa para las reacciones. Se debe añadir una unidad de ADN polimerasa por reacción al volumen apropiado de tampón de rehidratación, el cual variará según el tac utilizado; en esta demostración se utilizará el jumpstart TAC D 93 0 7 en cinco reacciones, tres muestras más un control positivo y un control negativo.

Coloque el volumen calculado de polimerasa de ADN en un tubo limpio para microcentrífuga y añada a continuación el volumen calculado de tampón de rehidratación. Mezcle suavemente el tampón de rehidratación de la polimerasa de ADN golpeando ligeramente el tubo. No vortex esta mezcla.

Utilice los tubos de reacción transparentes proporcionados en el kit para preparar el control negativo y las muestras. Estos tubos de reacción ya contienen los nucleótidos, los cebadores y el ADN del control interno; pipete 23 microlitros del tampón de rehidratación de la ADN polimerasa previamente preparado. Mezcle en cada uno de los tubos del control negativo y de las muestras.

Luego, agregue dos microlitros de agua libre de ADN al control negativo y dos microlitros de cada muestra a los tubos respectivos. Mezcle el contenido agitando ligeramente los tubos. No vortexe los contenidos.

Para preparar el control positivo, utilice los tubos de reacción rosados proporcionados en el kit. Estos tubos de reacción ya contienen los nucleótidos, cebadores y ADN del control interno; añada 25 microlitros de la mezcla tampón de rehidratación de la ADN polimerasa al tubo de reacción. Mezcle el contenido agitando suavemente el tubo; no debe usar el vórtex.

Luego, incubar los tubos de control positivo, control negativo y las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de cinco minutos, transferir todos los tubos de reacción a un termociclador. Para la PCR, establecer las siguientes condiciones durante 40 ciclos.

94 grados Celsius durante 30 segundos. 55 grados Celsius durante 30 segundos y 72 grados Celsius durante 40 segundos. No se requiere un paso de activación al usar Jumpstart tack.

Una vez finalizados los ciclos de PCR, retire las muestras del termociclador y colóquelas en hielo para enfriarlas a entre cuatro y ocho grados Celsius. Luego, las muestras pueden cargarse directamente en un gel de agarosa para electroforesis: cargue ocho microlitros de cada reacción de PCR en un carril separado. No es necesario agregar tampón ni colorante antes de cargar las muestras, ya que estos componentes ya están incluidos en los tubos de reacción.

Detenga la electroforesis después de que el colorante marcador haya migrado de 2,5 a tres centímetros. En esta imagen de una banda de gel aros se muestran resultados representativos de la detección de micoplasma mediante PCR. La muestra 2 es el control negativo, que debe mostrar una banda a aproximadamente 481 pares de bases.

La ausencia de la banda del control negativo a 481 pares de bases es un buen indicador de que la TAC utilizada no fue lo suficientemente sensible. Las muestras positivas para micoplasma mostrarán bandas en el rango de 270 ± 8 pares de bases, como se observa en las carreras tres a seis. La banda será intensa en muestras altamente contaminadas y débil en muestras ligeramente contaminadas.

Todas las muestras contienen un control negativo interno para demostrar que la PCR ocurrió como se esperaba. Es normal observar la ausencia del control interno en muestras altamente contaminadas. La ausencia de una banda tanto en el rango positivo como en el negativo, como se muestra en la banda siete, es un buen indicador de que las muestras están inhibidas.

Si la muestra está inhibida, los inhibidores de la PCR se pueden eliminar realizando una extracción de ADN. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar todos los pasos necesarios descritos en el procedimiento del kit, así como de interpretar los resultados y solucionar problemas cuando sea necesario.