Name: La reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • Hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprende a reconstituir bioquímicamente complejos proteicos GR•Hsp90 y reactivar la unión de ligandos esteroideos. Este método permite estudiar requisitos de cofactores y efectos de compuestos exógenos en la señalización de receptores esteroides.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención GM086822, Hope Heart Institute premio de Ciencias Básicas, y el MJ Murdock Charitable Trust Programa Facultad de Ciencias de la Investigación. Seleccionar los reactivos de electroforesis y el software de análisis de imágenes fueron generosamente proporcionadas por Bio-Rad.

<ol><li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signaling+protein+function+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery.</a> Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucocorticoid+receptor+steroid+binding+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%3A+implications+for+clinical+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention.</a> Leukemia. 19, 710-712 (2005).</li>
<li>Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery+regulates+signaling+by+modulating+ligand+binding+clefts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts.</a> J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).</li>
<li>Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+steroid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+assembly+system+of+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).</li>
<li>Morishima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp+organizer+protein+hop+enhances+the+rate+of+but+is+not+essential+for+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+multiprotein+Hsp90-based+chaperone+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system.</a> J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry%2C+abundance%2C+and+functional+significance+of+the+hsp90%2Fhsp70-based+multiprotein+chaperone+machinery+in+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).</li>
<li>Dittmar, K. D., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+glucocorticoid+receptor+by+the+reconstituted+Hsp90-based+chaperone+machinery.+The+initial+hsp90.p60.hsp70-dependent+step+is+sufficient+for+creating+the+steroid+binding+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation.</a> J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).</li>
<li>Kanelakis, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+the+hsp70-binding+protein+BAG-1+on+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+hsp90-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).</li>
<li>Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+iterative+ratcheting+of+receptor-bound+hsp70+between+its+ATP+and+ADP+conformations+during+assembly+of+glucocorticoid+receptor.hsp90+heterocomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes.</a> Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pifithrin-alpha+inhibits+p53+signaling+after+interaction+of+the+tumor+suppressor+protein+with+hsp90+and+its+nuclear+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation.</a> J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+resolves+two+sequential+ATP-dependent+events+involving+first+hsp70+and+then+hsp90+in+opening+of+the+steroid+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).</li>
<li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+receptor+interactions+with+heat+shock+protein+and+immunophilin+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones.</a> Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).</li>
<li>Bodwell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+phosphorylated+sites+in+the+mouse+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor.</a> J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).</li>
<li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Protein Ubiquitination.</a> J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%26bull%3BHsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&bull;Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM%3A+Immunoprecipitation+Detected+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).</li>
<li>Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functioning+of+the+Hsp90+machine+in+chaperoning+checkpoint+kinase+I+%28Chk1%29+and+the+progesterone+receptor+%28PR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR).</a> Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).</li>
<li>Cintron, N. S., Toft, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+requirements+for+Hsp40+and+Hsp70+in+the+Hsp90+chaperone+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway.</a> J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).</li>
</ol>

Seleccionar los reactivos de electroforesis y el software de análisis de imágenes fueron proporcionadas por Bio-Rad.

El ensayo descrito anteriormente se puede adaptar para poner a prueba un gran número de condiciones que afectan a las acciones acompañante de la maquinaria acompañante hsp90/hsp70-based así como enlazar GR esteroides. Se trata de una modificación de los métodos previamente reportados 4,8,9,17 y está diseñado para aprovechar los avances recientes en tecnología de electroforesis y ser accesible a una comunidad de investigación más amplio. Cofactores adicionales o proteínas de interés se pueden añadir a la GR • ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Células de insecto Sf9 </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> para la expresión de baculovirus recombinante de ratón GR </td></tr><tr><td> Células L929 </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> endógeno del ratón GR citosol preparación (alternativa a la expresión de baculovirus) </td></tr><tr><td> FiGR células hibridoma </td><td> ATCC </td><td> CRL-2173 </td><td> para la preparación de ascitis que contiene anti-GR anticuerpo monoclonal (alternativa a los anticuerpos purificados BuGR2) </td></tr><tr><td> Completa Mini-inhibidor de la proteasa, EDTA libre </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> proteína A-Sepharosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> lisado de reticulocitos de conejo </td><td> Hectáreas verde (Oregon, WI) </td><td></td><td> rica fuente de maquinaria endógena acompañante hsp90/hsp70 </td></tr><tr><td> creatinfosfocinasa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td><td> de ATP-sistema de regeneración </td></tr><tr><td> fosfocreatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td><td> de ATP-sistema de regeneración </td></tr><tr><td> anti-GR anticuerpo monoclonal de ratón (BuGR2) </td><td> Pierce / Thermo Scientific </td><td> MA1-510 </td><td> utilizado para GR inmunoadsorción y los anticuerpos primarios como en el Western Blot </td></tr><tr><td> anti-HSP90 anticuerpo monoclonal de ratón (AC88) </td><td> Enzo Ciencias de la Vida </td><td> ADI-SPA-830 </td><td> utilizado como anticuerpo primario en el Western Blot </td></tr><tr><td> anti-HSP70 anticuerpo monoclonal de ratón (N27F3-4) </td><td> Enzo Ciencias de la Vida </td><td> ADI-SPA-820 </td><td> utilizado como anticuerpo primario en el Western Blot </td></tr><tr><td> IgG de suero de ratón </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 038K7690 </td><td> utilizados como anticuerpos inmunes para el control negativo de inmunoadsorción </td></tr><tr><td> IgG anti-ratón-peroxidasa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4416 </td><td> utilizó como anticuerpo secundario en el Western Blot </td></tr><tr><td> Experion microfluidos sistema de electroforesis </td><td> Bio-Rad </td><td> 7007001 </td><td> alternativa a las SDS-PAGE </td></tr><tr><td> [1,2,4,6,7 - 3 H] dexametasona </td><td> PerkinElmer </td><td> NET1192001MC </td><td> seguir las precauciones de seguridad </td></tr></tbody></table>

la reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 es una proteína chaperona molecular esencial y muy abundante que se ha encontrado para regular más de 150 proteínas eucariotas de señalización, incluyendo los factores de transcripción (por ejemplo, los receptores nucleares, p53) y las proteínas quinasas (por ejemplo, Src, Raf, Akt cinasa) que participan en el ciclo celular, tumorigénesis, la apoptosis, y múltiples vías de señalización 1,2 eucariotas. Muchos de estos &quot;clientes&quot; de las proteínas hsp90, el montaje de receptores de esteroides • hsp90 complejos es el mejor definidos (Figura 1). Presentamos aquí un receptor adaptable glucocorticoides (GR) ensayo de inmunoprecipitación e in vitro GR • hsp90 método de reconstitución que puede ser fácilmente utilizada para explorar eucariotas hsp90 actividad funcional, hsp90 mediada por ligando de unión al receptor de esteroides, y los requisitos de cofactor molecular acompañante. Por ejemplo, este ensayo puede ser utilizado para probar los requisitos de hsp90 cofactor y los efectos de la adición de compuestos exógenos al proceso de reconstitución. El GR ha sido un sistema muy útil para el estudio de hsp90 porque el receptor debe estar enlazado a hsp90 para tener una unión del ligando libre hendidura que sea accesible a los esteroides 3. GR endógeno, unliganded está presente en el citoplasma de las células de los mamíferos no covalentemente unido a hsp90. Como se encuentra en la GR • hsp90 endógeno heterocomplex, la unión del ligando GR hendidura abierta y capaz de unirse con esteroides. Si hsp90 se disocia de los recursos genéticos o si su función se inhibe, el receptor es incapaz de unirse con esteroides y requiere la reconstitución de la GR • hsp90 heterocomplex antes de la actividad de unión de esteroides se restaura 4. GR se puede immunoprecipitated de citosol de la célula utilizando un anticuerpo monoclonal, y las proteínas, tales como hsp90 complejos con el GR se puede analizar por Western blot. Actividad de unión de los esteroides GR immunoprecipitated se puede determinar mediante la incubación de la immunopellet con [3H] esteroides. Los experimentos anteriores han demostrado hsp90 mediada por la apertura de la unión del ligando GR hendido requiere Hsp70, una chaperona molecular segundo también es esencial para la viabilidad de las células eucariotas. Actividad bioquímica de HSP90 y HSP70 son catalizadas por la co-Hop acompañante proteínas HSP40, y 5 de p23. Una maquinaria acompañante multiproteico que contiene HSP90, HSP70 Hop, y HSP40 son endógena presente en el citoplasma de la célula eucariota, y lisado de reticulocitos proporciona una acompañante-rica fuente de proteínas 6. En el método presentado, GR es immunoadsorbed de citosol de la célula y despojado de la maquinaria acompañante endógeno hsp90/hsp70 con condiciones suaves de sal. El GR-sal despojado se incuba con lisado de reticulocitos, ATP, y K +, lo que resulta en la reconstitución de la GR • hsp90 heterocomplex y la reactivación de la actividad de unión de esteroides 7. Este método puede ser utilizado para probar los efectos de varios cofactores acompañante, nuevas proteínas, y los inhibidores de HSP90 experimental o GR con el fin de determinar su significado funcional de hsp90 mediada por esteroides vinculante 11.08.

Un<em&gt; In vitro</emMétodo&gt; para la preparación funcional del receptor de glucocorticoides (GR) • hsp90 complejos de proteínas de las proteínas purificadas y lisados ​​celulares se describe. El método utiliza inmunoadsorción de GR recombinante seguido por la sal-stripping y la reconstitución de proteínas complejas. La importancia de los cofactores y las condiciones de amortiguación se discuten, como lo son las posibles aplicaciones del método.

La reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • Hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando

La Hsp90 es una proteína chaperona molecular esencial y muy abundante que, según se ha descubierto, regula más de 150 proteínas de señalización eucariotas, ...

El objetivo general de este procedimiento es reconstituir bioquímicamente un complejo proteico del receptor de esteroides con HSB 90 y reactivar la actividad de unión del ligando al receptor de esteroides, lo cual puede utilizarse para evaluar los requisitos de cofactores de HSB 90 y los efectos de añadir compuestos exógenos al proceso de reconstitución. Esto se logra primero preparando un citosol celular que contenga receptores glucocorticoides funcionales. A continuación, el RG del citosol celular se inmunoabsorbe y se elimina el componente endógeno.Se disocia la HSP 90. Luego, se reconstituye el heterocomplejo GR-HSP 90 utilizando una fuente exógena de HSP 90 y otras proteínas de choque térmico, así como cofactores. Finalmente, se analizan específicamente los complejos proteicos reconstituidos y la actividad de unión al ligando; métodos como electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, transferencia western y ensayos de unión a ligandos radiactivos se utilizan para demostrar la formación del heterocomplejo GR-HSP 90 y la actividad de unión a esteroides.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la chaperona molecular HSP 90, como qué cofactores chape

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Biología

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Aprende a reconstituir bioquímicamente complejos proteicos GR•Hsp90 y reactivar la unión de ligandos esteroideos. Este método permite estudiar requisitos de cofactores y efectos de compuestos exógenos en la señalización de receptores esteroides.

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