La reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • Hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando

El objetivo general de este procedimiento es reconstituir bioquímicamente un complejo proteico del receptor de esteroides con HSB 90 y reactivar la actividad de unión del ligando al receptor de esteroides, lo cual puede utilizarse para evaluar los requisitos de cofactores de HSB 90 y los efectos de añadir compuestos exógenos al proceso de reconstitución. Esto se logra primero preparando un citosol celular que contenga receptores glucocorticoides funcionales. A continuación, el RG del citosol celular se inmunoabsorbe y se elimina el componente endógeno.

Se disocia la HSP 90. Luego, se reconstituye el heterocomplejo GR-HSP 90 utilizando una fuente exógena de HSP 90 y otras proteínas de choque térmico, así como cofactores. Finalmente, se analizan específicamente los complejos proteicos reconstituidos y la actividad de unión al ligando; métodos como electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, transferencia western y ensayos de unión a ligandos radiactivos se utilizan para demostrar la formación del heterocomplejo GR-HSP 90 y la actividad de unión a esteroides.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la chaperona molecular HSP 90, como qué cofactores chaperonas y chaperonas COS son necesarios para facilitar la actividad funcional de HSP 90. Aunque este método puede proporcionar información sobre el plegamiento de proteínas, también puede aplicarse a otros sistemas, como el desarrollo de compuestos iniciales dependientes de HSP 90 y el análisis de vías de señalización intracelular que requieren HSP 90. Realizarán el procedimiento Hannah Franklin y Nathan, dos estudiantes recién graduados de mi laboratorio. Para aislar el receptor de glucocorticoides funcional o GR, cultive células de fibroblastos murinos L 9 29 o células SF nueve que hayan sido infectadas con el virus recombinante GR bao y que se encuentren en fase de crecimiento exponencial. Centrifugue la suspensión celular a 5,000 Gs durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

El pellet resultante debe tener un volumen de aproximadamente uno a cinco mililitros. Lave el pellet celular tres veces con 15 mililitros de solución salina tamponada con Hank. Prepare 1,5 volúmenes de tampón de homogenización que contenga tampón HEM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) uno milimolar y tres tabletas completas de inhibidor de proteasas mini molidas mediante 50 golpes de un mortero.

El homogenizador rompió las células; realice este paso sobre hielo para prevenir la degradación de proteínas. Ultracentrifugue el homogenato a 100.000 Gs durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Ali-cuote el sobrenadante que contiene el citosol en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros, con 500 microlitros cada uno, y almacénelos a menos 20 grados Celsius.

Para preparar una mezcla que contenga un anticuerpo monoclonal IgG dirigido contra el receptor específico GR, combine 100 microlitros de citosol de GR descongelado, 200 microlitros de tampón TEGM, 100 microlitros de una suspensión al 20 % de proteína asero o PAS y cinco microgramos de un anticuerpo monoclonal IgG anti-G, como bugger dos. Debido al tamaño relativamente grande de las perlas de PAS.

Utilice una punta cortada de pipeta P200 para transferir PAS desde la suspensión al 20 % a los tubos de muestra. Coloque las muestras en una rueda rotatoria vertical e incube durante un mínimo de dos horas con rotación constante. A continuación, elimine las proteínas no unidas del precipitado de PAS con anticuerpo mediante centrifugación de las muestras en una centrífuga refrigerada durante un minuto.

A 10.000 Gs, lave el precipitado dos veces añadiendo un mililitro de tampón TEGM, vortexeando y luego centrifugando. Retire la última lavada utilizando una punta de pipeta P 200 doblada para disociar la HSB 90 endógena del precipitado inmuno de GR y añada 355 microlitros de tampón TEG y 45 microlitros de cloruro de sodio cinco molar al anticuerpo. Precipitado PAS previamente preparado.

Coloque las muestras en una rueda rotatoria vertical e incube durante una hora y media con rotación constante. Elimine las proteínas no unidas del pellet inmuno mediante centrifugación durante un minuto a 10,000 Gs. Lave el pellet una vez con un mililitro de tampón TEG y una vez con un mililitro de heaps 10 milimolares. Tampón pH 7,4 Utilizando una punta de pipeta P200 sellada, retire el lavado, teniendo cuidado de no perturbar el pellet.

Para reconstituir el complejo heteromérico GR HSB 90, añada al precipitado una mezcla que contenga 50 microlitros de una fuente de chaperonas moleculares, como un lisado de reticulocito de conejo, y cinco microlitros de un sistema de generación de ATP. Este siguiente paso es fundamental para asegurar una mezcla adecuada del precipitado y la solución de reconstitución. Incube las muestras en un baño de agua a 30 grados Celsius durante exactamente 20 minutos.

Agite suavemente los tubos cada uno o dos minutos para deshacer ligeramente el precipitado y mezclar la solución de reconstitución. Añada un mililitro de tampón TEGM, vortexee y centrifugue a 10.000 G durante un minuto. Retire el sobrenadante teniendo cuidado de no perturbar el precipitado.

Repita el lavado otras dos veces para identificar las proteínas en el sedimento reconstituido. Prepare las muestras para electroforesis añadiendo 50 microlitros de tampón de muestra para electroforesis SDS-PAGE que contenga beta-mercaptoetanol. Vortexee las muestras y luego incúbelas durante cinco minutos en un baño de agua hirviendo o en un bloque calefactor electrónico a 100 grados Celsius.

Centrifugar las muestras a 10,000 Gs durante un minuto. Utilice el sobrenadante de estas muestras para SDS-PAGE o electroforesis microfluídica seguida de western blot. Usar una punta de P200 recortada para cargar el sobrenadante limitará la aspiración accidental del precipitado.

El siguiente paso consiste en analizar el complejo proteico GR-HSP90 en busca de actividad de unión a esteroides. Utilizando un esteroide tritiado, comience añadiéndolo al pellet inmuno reconstituido: 47,5 microlitros de tampón HEM y 2,5 microlitros de dexametasona tritiada dos micromolar.

Mezcle suavemente el precipitado teniendo cuidado de minimizar la cantidad de muestra desplazada hacia la pared del tubo de microcentrífuga. Incube la muestra durante toda la noche sin alterarla sobre hielo. Añada un mililitro de tampón TEGM, mezcle suavemente y centrifugue a 10.000 GS durante un minuto.

Deseche el sobrenadante con precaución. Contiene esteroide tritiado no unido. Repita para un total de tres lavados con tampón TEGM completamente. Retire todo el sobrenadante al finalizar el lavado final.

Utilizando una punta de pipeta P 200 abocinada, suspenda los pellet inmunes lavados en 200 microlitros de tampón TEGM y transfiera a 10 mililitros. Viales de centelleo.

Añada 4,8 mililitros de cóctel de centelleo a los viales y vortexee. Finalmente, realice espectrometría de centelleo líquido; datos representativos de electroforesis SDS-PAGE e inmunotransferencia se muestran aquí en este gel teñido con kumasi. El complejo heteromérico endógeno GR-HSP90 se inmunoadsorbe del citosol celular utilizando anticuerpos anti-GR y las proteínas individuales que se adsorben junto con el GR se visualizan y se muestran.

Aquí se muestran datos de electroforesis microfluídica de Experian que representan complejos heteroméricos reconstituidos de GR y HSP 90. La especificidad de la inmunoabsorción de GR se confirma sustituyendo el anticuerpo anti-GR inmunoabsorbente por un anticuerpo no inmune, incluso cuando se utilizan cantidades excesivas. No se inmunoprecipitan ni GR ni chaperonas moleculares.

Asimismo, es posible confirmar la disociación de HSP 90 y otras proteínas de chaperona del GR despojado con sal mediante un western blot de los pellet inmuno despojados y reconstituidos. La cadena pesada del anticuerpo inmunoabsorbente es detectable tanto por tinción de kumasi como por western blot, y confirma que en cada carril se están visualizando pellet inmuno de tamaño igual. Aquí se presentan datos representativos de actividad de unión a esteroides del GR inmunoabsorbente utilizando ya sea lisado de reticulocitos o proteínas purificadas.

La actividad de unión de esteroides del complejo heteromérico reconstituido GR-HSP90 suele recuperar entre el 75 y el 100 % del nivel de actividad de unión del complejo endógeno GR-HSP90. De forma similar a los datos de electroforesis, puede utilizarse un anticuerpo no inmune en lugar del anticuerpo anti-GR como control negativo y como medida de la unión no específica del esteroide tritiado. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la electroforesis en gel bidimensional, con el fin de responder preguntas adicionales, como qué impacto tienen las modificaciones postraduccionales de HSP90 en la reconstitución del complejo heteromérico y en la unión de esteroides. Los ensayos de reconstitución, como los descritos aquí, han permitido a los investigadores explorar la importancia funcional del sistema de chaperonas multiproteica basado en HSP90 y HSP70, así como su ensamblaje escalonado, utilizando el receptor de glucocorticoides como proteína cliente modelo de HSP90.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar complejos funcionales de proteínas del receptor de glucocorticoides y HSP 90 a partir de proteínas purificadas en lisados celulares. Los pasos utilizados incluyen la preparación del lisado celular que contiene el receptor GR, la absorción inmune del receptor, la eliminación por sal de las proteínas endógenas y la reconstrucción del complejo heteromérico utilizando HSP 90 exógena, cofactores HSP 70 y co-chaperonas.