La interacción hidrofóbica automatizada cromatografía en columna de selección para uso en la purificación de proteínas

El objetivo general de este procedimiento es seleccionar una columna óptima de cromatografía líquida por intercambio iónico utilizando un método automatizado de exploración para la purificación de una proteína recombinante con un sistema de cromatografía líquida de presión media BioRad DUO flow. Esto se logra primero preparando los tampones necesarios y los lisados bacterianos que contienen la proteína recombinante de interés. A continuación, se configura físicamente el sistema de cromatografía duo flow, se conecta la tubería y se prepara para el protocolo de exploración.

Luego, se cargan las muestras y se ejecuta el método programado de exploración de columnas HI para recopilar la muestra fraccionada eit. Finalmente, se analiza el EIT y se identifica la columna HI y el medio óptimos según las características de separación observadas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren un medio de columna HI preferido para la purificación a escala del proteína de interés del investigador mediante cromatografía líquida de presión media utilizando las capacidades automatizadas de exploración de columnas HI con flujo DUO.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como corridas secuenciales de cromatografía en columna manual es que la automatización del proceso disminuye la variabilidad y garantiza resultados altamente reproducibles. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades debido a la complejidad física de los sistemas modernos de cromatografía líquida. Sin embargo, esto puede dominarse fácilmente.

Tras una práctica suficiente, la demostración del procedimiento estará a cargo de Orange Stone y Shelly Anderson, dos estudiantes de mi laboratorio. Para comenzar, prepare 500 mililitros de los siguientes tampones: 200 milimolar de fosfato de sodio para el tampón A1, 200 milimolar de fosfato de hidrógeno de sodio para el tampón A2 y 4,8 molar de sulfato de amonio. Para el tampón B2, el agua desionizada actuará como tampón B1. Desgasifique los tampones para garantizar condiciones óptimas de operación cromatográfica. El sistema maximizador mezclará los tampones A1 y A2 para generar un tampón de elución de fosfato de baja salinidad, y mezclará los tampones B1 y B2 para generar el sulfato de amonio de alta salinidad.

Tampón de inicio. Prepare 20 mililitros de muestra para cargar mezclando 10 mililitros de lisado celular que contenga la proteína que se va a purificar con 10 mililitros del tampón B dos. La concentración final de sulfato de amonio en la solución de lisado celular debe ser aproximadamente 2,4 molar, lo que la hace aproximadamente equivalente al tampón de inicio.

Filtre la mezcla de tampón de lisado a través de un filtro para jeringa de baja unión a proteínas de 0,45 micrómetros para eliminar las partículas en suspensión de la solución. Mantenga la muestra en hielo hasta que esté lista para cargarse en el sistema. La configuración física y las conexiones del sistema de cromatografía son uno de los aspectos más complicados de este procedimiento.

Configure el sistema de cromatografía de flujo dual según el diagrama mostrado aquí. Asegúrese de que haya volúmenes adecuados de tampón disponibles para todo el protocolo y de que los tubos permanezcan sumergidos continuamente. Conecte la válvula de carga de muestra y el bucle de muestra dinámico como se ilustra aquí, y conecte el bucle de muestra a la entrada de la válvula de muestra en la posición tres.

Prepare ocho pares de tamaño idéntico de tubo capilar con un diámetro externo de un dieciseisavo de pulgada. Luego, conecte los pares a las posiciones del uno al ocho de las dos válvulas de selección de columna. Después de encender las lámparas del detector UV y confirmar que todos los detectores están calibrados, conecte la válvula divisora del colector de fracciones y el controlador divisor según se ilustra aquí.

La válvula divisora del colector de fracciones en la posición dos y el controlador divisor se operan fuera de línea respecto a la estación de trabajo de cromatografía. Ajuste el porcentaje de división al 10. Sustituya la cabeza dispensadora estándar del colector de fracciones en la posición dos por una cabeza dispensadora para microplaca.

Lave el bucle de muestra y purgue el sistema de cromatografía. A continuación, inicie un flujo manual de un mililitro por minuto de tampón de evolución a través del sistema. Conecte columnas HI de trampa alta de un mililitro a las posiciones dos a ocho de las válvulas de selección de columna.

Retire la unión que conecta las válvulas de selección de columna de la posición dos. Conecte los accesorios de la columna aguas arriba al flujo doble. Pase el tampón eluyente a través de los accesorios hasta que se expulse todo el aire y se forme una gota grande de tampón.

A continuación, retire el tapón conectado a la entrada de la columna y coloque una gota grande de tampón de baja salinidad en la parte superior de la columna. Luego, conecte la columna a los accesorios aguas arriba. Conecte la salida a los accesorios de la columna aguas abajo y al tubo de la válvula de selección.

Establezca el límite de presión de contrapresión en 40 PS.I lave la columna con cinco volúmenes de columna. Buffer Evolution a un flujo de un mililitro por minuto. Lave la columna con 10 volúmenes de columna del buffer inicial a un flujo de un mililitro por minuto.

Una vez que las trazas UV de pH y la presión posterior se hayan estabilizado, cambie manualmente las válvulas de selección de columna a la posición uno y detenga el flujo de tampón. Para cargar una muestra, sumerja el tubo de entrada de la muestra en la muestra de 20 mililitros. Luego, cambie la válvula de lavado de carga del bucle de muestra a la posición uno y la válvula de carga de la muestra a purga.

Inicie la acción de la bomba de carga del bucle de muestra, aspirando la muestra hacia el tubo de la bomba a un caudal de un mililitro por minuto hasta inmediatamente después de que la muestra alcance la válvula de carga de muestra. Cambie la válvula de carga de muestra de purga a carga. Reinicie la bomba de carga del bucle de muestra a un caudal de un mililitro por minuto hasta que se hayan aspirado 10 mililitros de muestra hacia el bucle de muestra dinámico desde la ventana de configuración del software biológico.

Seleccione los dispositivos del sistema marcados con un asterisco en esta tabla. A continuación, seleccione seis columnas de CIC para el programa de ensayo. Un gradiente lineal descendente de sal y un método exploratorio de seis columnas inician manualmente el flujo del tampón inicial a un mililitro por minuto.

Pulse el botón de inicio en el controlador del divisor para comenzar inmediatamente la división del flujo de 90 % a 10 % EIT justo después de iniciar la ejecución del método del programa; pulse el botón de inicio en el panel de control en pantalla del colector fraccionador fuera de línea de placa de 96 pocillos. Observe la visualización en tiempo real para confirmar los parámetros esperados del ensayo. Compare el trazado de absorbancia específico de GFP a 397 nanómetros con el trazado de absorbancia de proteína general a 280 nanómetros para estimar la separación y purificación relativas utilizando los diferentes medios HI que se están evaluando. Alícuotas de cinco a 50 microlitros provenientes de las fracciones de la placa de 96 pocillos pueden transferirse a una placa nueva y analizarse por ELISA o inmunotransferencia tipo Western para determinar el contenido específico de proteína, y el contenido total de proteína mediante SDS-PAGE o un sistema de electroforesis microfluídico Experion. Aquí se muestran la conductividad representativa del gradiente salino de Hick y la presión de la columna de los ensayos exploratorios.

El cambio en la concentración de sal, medido mediante el porcentaje de tampón extraído de las líneas de tampón de alta salinidad, es típico de la metodología HI. A medida que disminuye la concentración de sal, las proteínas unidas a la columna se eluyen en función de la conductividad, que corresponde a la concentración de sal observada; esta concentración se mide en línea inmediatamente después de los detectores quad tech y UV. La diferencia entre el gradiente de sal y los trazos de conductividad indica el tiempo necesario para que el tampón recorra desde la entrada del tampón a través del sistema hasta el monitor de conductividad.

Durante todo el análisis, la presión del sistema y el pH permanecen relativamente constantes. Esta figura muestra cromatogramas de corridas secuenciales de exploración en columna HI con detección en línea de proteína total. La NGFP se realiza midiendo la absorbancia de la luz a 280 nanómetros y 397 nanómetros, respectivamente.

Es posible aproximar la abundancia relativa de GFP y la separación para cada corrida exploratoria. Al comparar las dos líneas de esta figura, los tubos de cultivo para las fracciones 10, 12, 14, 16 y 18 de la corrida exploratoria de FF de hinojo se visualizaron bajo luz ambiente o luz fluorescente de sala, y los tubos bajo luz ultravioleta se observaron tanto de frente como desde arriba, con el fin de detectar el espectro de emisión característico de GFP, que se identifica claramente en la fracción 14. En ambas imágenes UV, el azul difuso en el panel izquierdo corresponde a la luz emitida por la lámpara UV.

Estos datos posteriores a la corrida coinciden bien con la detección en línea de GFP mediante la medición de la absorbancia del eluido a 397 nanómetros, lo que también identifica la fracción 14 como la que contiene el pico principal de GFP aludida. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como inmunotransferencia (western blot), ELISA, microscopía de fuerza atómica y ensayos de reconstrucción bioquímica para responder preguntas adicionales relacionadas con la pureza y la actividad funcional de la proteína que se está purificando.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar la necesidad de control manual del sistema de flujo dual en varios puntos del método. Ejemplos incluyen el rellenado de tampón y la carga de la muestra, la verificación de la presencia de burbujas de aire y el encendido y apagado de las lámparas de detección según sea necesario. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar un sistema de cromatografía líquida para realizar un reconocimiento automatizado de columnas y medios HI óptimos.

El análisis evaluado en línea y en formato póster permitirá al investigador seleccionar una columna adecuada para la purificación a mayor escala, la cual también podría combinarse con otros métodos cromatográficos para aumentar la pureza y el rendimiento de la proteína diana.