Aislamiento magnético de microglía a partir de cerebros de cachorros de ratón

La microglía, los macrófagos residentes en el cerebro, expresan CD11b, una integrina de la superficie celular.

Para aislar la microglía de los cerebros de las crías de ratón, tome fragmentos de cerebro en tubos de disociación que contienen tampón con papaína, una enzima proteolítica, y desoxirribonucleasa.

Coloque los tubos en un disociador mecánico. Durante la carrera, el disociador altera mecánicamente el tejido.

La papaína digiere la matriz extracelular del tejido, liberando células, incluida la microglía, en suspensión. La desoxirribonucleasa degrada el ADN libre en suspensión, evitando el aislamiento celular ineficiente.

centrífuga. Complete la disociación mecánica pipeteando. Transfiera la suspensión a través de un filtro celular para eliminar los desechos y los grupos celulares, y obtenga una población unicelular homogénea.

Incubar con microperlas superparamagnéticas funcionalizadas con anticuerpos anti-CD11b. Las microperlas se unen específicamente a CD11b en las células, incluida la microglía.

Post-incubación, centrífuga. Retire el sobrenadante que contiene las cuentas sin unir. Vuelva a suspender las celdas en el búfer. Cargue en una columna colocada en un separador magnético. La columna está formada por una matriz con perlas ferromagnéticas.

Cuando se colocan en el separador, las esferas dentro de la columna amplifican el campo magnético, reteniendo las células CD11b + unidas a microperlas dentro de la columna, mientras que otras células fluyen.

Retirar del separador y usar tampón para eluir las células CD11b+ de la columna. Centrifugar la suspensión y volver a suspender las células CD11b+ en un medio de microglía.

Las células aisladas están listas para un análisis más detallado.

Prepare la mezcla de disociación de acuerdo con esta tabla. Transfiera 12 piezas cerebrales a un tubo C para un peso total de 1,2 gramos por tubo de disociación. Luego, coloque los tubos en C en el disociador con calefacción. Inicie el programa NTDK optimizado en el disociador. Centrifugar durante 20 segundos. Complete la disociación mecánica pipeteando tres veces.

Transfiera las celdas a cuatro tubos de 15 mililitros con filtros adjuntos. Enjuague los coladores con 10 mililitros de HBSS con calcio y magnesio. Centrifugar durante 10 minutos y retirar el sobrenadante con una pipeta de 10 mililitros. Con cuidado, agregue 10 mililitros de HBSS con calcio y magnesio y vuelva a suspender el gránulo. Nuevamente, centrifugar y eliminar el sobrenadante.

Vuelva a suspender el pellet con 6 mililitros de tampón de clasificación. Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante. Luego, agregue 200 microlitros de solución de microperlas CD11b e incube los tubos durante 15 a 20 minutos a 4 grados centígrados. Después de la incubación, vuelva a suspender el gránulo con 6 mililitros de tampón de clasificación. Repita la centrifugación y vuelva a suspender el gránulo con 8 mililitros de tampón de clasificación.

A continuación, siga el programa POSSEL en el separador para preparar ocho columnas. Pase las celdas a través de la columna agregando 1 mililitro de suspensión celular a la vez. Con 1 mililitro de tampón de clasificación, eluya las células positivas para CD11b en una placa de elución estéril. Reúna las células en un tubo de 50 mililitros.

Centrifugar y resuspender el pellet con 10 mililitros de medio microglía frío. Cuente las células CD11b positivas. Vuelva a suspender las células en medio de microglía fría para obtener una concentración final de 650,000 a 700,000 células por mililitro.