Evaluación de la colitis inducida por químicos mediante análisis inmunohistoquímico de secciones de tejido del colon

En ratones, la capa mucosa del colon consiste en células inmunes que contienen lámina propia, rodeadas por un epitelio apretado que protege la mucosa. El tratamiento químico con sulfato de sodio dextrano interrumpe las uniones estrechas, causando daño a las células epiteliales y permitiendo que los microbios luminales penetren en la lámina propia.

El reconocimiento microbiano en el colon desencadena la secreción de quimiocinas, lo que conduce a la infiltración de células inmunes y la liberación de citoquinas proinflamatorias. Esta respuesta inmune exagerada da como resultado inflamación del colon o colitis.

Para evaluar la colitis inducida por productos químicos, comience con un portaobjetos de vidrio que lleve una sección fija de tejido de colon de ratón pretratada que exhiba colitis inducida por productos químicos. Trate la sección con un cóctel de anticuerpos primarios específicos para los receptores de las células inmunitarias que se unen a sus respectivas células inmunitarias.

Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos. Incube la sección de tejido con anticuerpos secundarios biotinilados, que se unen específicamente a los anticuerpos primarios. Incubar con los conjugados estreptavidina-enzima, que interactúan con las biotinas, formando complejos.

Superponga la sección de tejido con un sustrato cromogénico; la interacción enzima-sustrato imparte coloración marrón a las células inmunitarias. Contratiña la sección con colorante de hematoxilina para teñir los núcleos celulares.

Observe el portaobjetos teñido bajo un microscopio. La abundancia de células inmunitarias marrones en el área dañada indica colitis inducida por sustancias químicas.

Para el análisis inmunohistoquímico, después de calentar las secciones durante 20 minutos en la placa caliente, lavar los portaobjetos tres veces en PBS durante 10 minutos por lavado y eliminar la peroxidasa endógena con una incubación de peróxido de hidrógeno al 3% de 10 minutos.

Al final de la incubación, lave las muestras tres veces en PBS como se ha demostrado y bloquee cualquier unión inespecífica con tampón de bloqueo, durante al menos una hora a temperatura ambiente. Luego, reemplace el tampón de bloqueo con el cóctel de anticuerpos primario de interés para una incubación nocturna a 4 grados Celsius.

A la mañana siguiente, aspire el exceso de solución de anticuerpos primarios y lave los portaobjetos tres veces en PBS. Después del último lavado, incube los portaobjetos con el cóctel de anticuerpos secundarios biotinilados apropiado seguido de un etiquetado con complejo de peroxidasa de rábano picante estreptavidina a temperatura ambiente.

Para visualizar las células inmunorreactivas, etiquete las muestras con DAB hasta que se desarrolle un color marrón claro u oscuro y contratiña las secciones con hematoxilina y amoníaco diluido al 0,3%.

Cuando los portaobjetos se hayan secado, use un microscopio óptico para obtener imágenes de campo claro de las secciones de tejido con un aumento de 10 veces y use un programa de procesamiento de imágenes para identificar y cuantificar la población de las células inmunes marcadas tanto en el epitelio como en la lámina propia.