Uso de la hibridación in situ de fluorescencia de inmunoARN para visualizar el SARS-CoV-2

Tomemos como ejemplo las células Vero infectadas con coronavirus fijas y permeabilizadas, una línea celular de mamíferos deficiente en interferón.

Dentro del huésped, el ARN viral está presente como subgenómico o sgRNA, moléculas de ARN de longitud intermedia que codifican proteínas virales específicas sintetizadas mediante transcripción.

Agregue sondas de reacción en cadena de hibridación o iniciador de HCR.

La sonda HCR se une a su secuencia complementaria en el ARN diana.

Introducir sondas de horquilla de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia, H-1 y H-2.

La sonda iniciadora se une a su cola H1 complementaria, linealizando la estructura de horquilla.

La secuencia H1 expuesta se une a su cola H2 complementaria.

La secuencia H2 final continúa uniéndose a una cola H1, amplificando las sondas marcadas con fluorescencia alrededor del área objetivo y generando una señal robusta.

Agregue los anticuerpos apropiados para visualizar el citoesqueleto de la célula huésped.

Tiñe los núcleos con DAPI.

Bajo un microscopio de fluorescencia, las células infectadas por virus muestran fluorescencia roja en el citoplasma, lo que indica la presencia del ARN diana.

Después de fijar y permeabilizar las células, como se describe en el manuscrito del texto, retire la solución de PBS 1x de los pocillos y agregue al menos 300 microlitros de tampón de amplificación a cada pocillo. Incube las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente. Prepare cada horquilla HCR enfriando rápidamente el volumen deseado en tubos separados.

Para preparar 300 microlitros de solución de amplificación, use 18 picamoles de cada horquilla. Transfiera la solución de horquilla a tubos e incube a 95 grados Celsius durante 90 segundos. Luego, enfríe a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Prepare una mezcla de horquilla añadiendo las horquillas H1 y H2 enfriadas a presión al tampón de amplificación. Coloque gotas de 30 a 50 microlitros de mezcla de horquillas en parafilm e incube las muestras durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.

Para montar las diapositivas, coloque dos gotas de 10 microlitros de medio de montaje en una diapositiva, asegurándose de que las gotas estén lo suficientemente separadas como para permitir que se coloquen dos cubreobjetos en una sola diapositiva. Elimine el exceso de líquido golpeando los cubreobjetos sobre una toalla limpia. Luego, colóquelos en un medio de montaje antidecoloración con las celdas hacia abajo. Coloque las muestras montadas sobre una superficie plana y seca en la oscuridad y déjelas curar.