Evaluación de la eficacia de un compuesto de prueba antiviral a través de un ensayo de inactivación viral

Tome tubos con un virus de la hepatitis C recombinante o una suspensión del VHC que contenga ARN que codifique un indicador de luciferasa secretado.

Agregue un compuesto de prueba antiviral y solvente a los tubos de prueba y control negativo.

Los compuestos de prueba se unen a las glicoproteínas del VHC, inactivando el virus.

Después de la incubación, diluya las mezclas para evitar interacciones compuesto-célula en pasos posteriores.

Agregue estas mezclas diluidas a las monocapas de hepatoma que apoyan la replicación del VHC. Incubar.

El VHC inactivado por compuestos no puede unirse a receptores específicos de la superficie celular, mientras que las glicoproteínas activas del VHC se unen a estos receptores, facilitando la unión celular.

Elimine los VHC no adsorbidos. Lave con tampón y agregue medios. Incubar durante un período prolongado.

El VHC unido se internaliza, libera ARN viral y conduce a la síntesis de proteínas virales y luciferasas, secretadas por la célula.

Recolecte los sobrenadantes de cultivo que contienen luciferasa. Centrifugar y agregar un sustrato de luciferasa a los sobrenadantes.

La luciferasa oxida el sustrato, emitiendo luz.

Una luminiscencia más alta en el pocillo de control que en la prueba indica inactivación viral por el compuesto.

Para comenzar el ensayo de inactivación viral, primero, coloque una placa 1 por 10 a la cuarta célula por pocillo en una placa de 96 pocillos. Incube las células a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante la noche para su adhesión. Para la infección, prepare partículas del virus de la hepatitis C o del VHC marcadas con reportero de Gaussia luciferasa, como se indica en el protocolo de texto.

En un tubo estéril, mezcle 100 microlitros de 100 micromolares CHLA o PUG con 100 microlitros de 10 a la cuarta unidad formadora de foco o FFU de HCV. Para un control positivo, mezcle el VHC con heparina a una concentración final de 1,000 microgramos por mililitro. Incubar a 37 grados centígrados durante tres horas.

Después de tres horas, diluya la mezcla del compuesto del virus 50 veces con 9,8 mililitros de medio basal a temperatura ambiente. Luego, prepare una nueva mezcla de compuestos virales e inmediatamente diluya esta mezcla en medio basal para la muestra de incubación de hora cero. Después de retirar el medio de incubación de las células, agregue 100 microlitros de la solución de fármaco viral diluido por pocillo por triplicado.

La solución ahora contiene 10 a la segunda FFU por pocillo. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres horas para permitir la infección viral de las células. Después de la incubación, retire la suspensión viral de los pocillos y lave suavemente las células con 200 microlitros de PBS dos veces.

Incubar las células en 100 microlitros de medio basal durante 72 horas para la replicación viral y la liberación del reportero de luciferasa en el sobrenadante. Luego, recolecte los sobrenadantes de los cultivos en microtubos y centrifugue a 17,000 veces g durante 5 minutos a 4 grados centígrados para eliminar los desechos celulares. Mezcle 20 microlitros de cada sobrenadante con 50 microlitros de reactivo de ensayo de luciferasa Gaussia y mida la luminiscencia de la actividad reportera de luciferasa en un luminómetro.