Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 2:38 min. • July 8th, 2025
Tome células de cáncer de hígado e incube a baja temperatura para afectar la endocitosis.
Introducir un virus de la hepatitis C o VHC recombinante, que comprende un genoma de ARN diseñado que codifica un indicador de luciferasa secretado.
Las lipoproteínas virales interactúan con los proteoglicanos en las células huésped, mientras que las glicoproteínas de la envoltura viral se unen a receptores específicos del huésped.
En pocillos seleccionados, agregue el compuesto de prueba que se une a las glicoproteínas virales.
Tras la incubación a temperatura fisiológica, los virus unidos son endocitados.
Deseche los virus no internalizados, agregue un medio de crecimiento e incube.
En los pocillos no tratados, las glicoproteínas ayudan a la fusión de la envoltura viral-endosoma, liberando la nucleocápside, mientras que el enmascaramiento compuesto perjudica la fusión en los pocillos tratados.
Tras la liberación, el ARN expresa proteínas virales, incluida la luciferasa, que se secreta extracelularmente.
Coseche el sobrenadante que contiene luciferasa y agregue un sustrato bioluminiscente, que es oxidado por la luciferasa para emitir luz.
Una disminución de la luminiscencia en los pocillos tratados en comparación con los no tratados indica la inhibición de la fusión envoltura viral-endosoma.
Para analizar la fusión y la entrada viral, enfríe previamente la placa de cultivo celular a 4 grados Celsius durante una hora después de la incubación nocturna para la unión celular. Retire el medio existente de los pocillos e infecte las células con 10 al segundo FFU HCV en hielo.
Incube la placa a 4 grados centígrados durante tres horas. Lave suavemente las células dos veces con 200 microlitros de PBS helado para eliminar el virus no adherido. Luego, en hielo, trate las células con un compuesto de prueba disuelto en medio basal o medio basal con DMSO al 1% como control, e incube la placa a 37 grados centígrados durante tres horas. Esto permite evaluar los compuestos de prueba en la entrada viral, que ocurre a 37 grados Celsius.
Aspire el medio y lave los virus no internalizados dos veces con 200 microlitros de tampón de citrato o PBS. Agregue 100 microlitros de medio basal por pocillo e incube a 37 grados centígrados durante otras 72 horas. Recoja el sobrenadante y realice el ensayo de luciferasa de Gaussia como se demostró anteriormente para detectar el reportero de luciferasa liberado.