Visualización basada en microscopía TIRF de la formación y el cierre de fagosomas

Tome un plato con fondo de vidrio recubierto de polímero que contenga glóbulos rojos opsonizados con IgG o glóbulos rojos adheridos a su superficie.

Coloque el plato en una platina de microscopio de fluorescencia de reflexión interna total, manteniéndolo a temperatura fisiológica.

Agregue macrófagos que contengan péptidos citoplasmáticos marcados con fluorescencia que se unan a la actina polimerizada, lo que facilita la visualización del citoesqueleto.

Durante la obtención de imágenes, dirija un rayo láser en un ángulo superior al ángulo crítico, lo que provoca una reflexión interna y la generación de ondas evanescentes en el punto de contacto.

Las ondas evanescentes iluminan selectivamente los fluoróforos en la interfaz vidrio-muestra, lo que permite la visualización en tiempo real de la fagocitosis.

Los receptores Fc de los macrófagos se unen a los glóbulos rojos opsonizados con IgG, lo que provoca la agrupación de receptores alrededor del área de contacto.

La agrupación desencadena vías de señalización intracelular y la activación de GTPasa, impulsando la polimerización de actina y el reclutamiento de dinamina, formando pseudópodos.

Los seudópodos se extienden alrededor de los glóbulos rojos, formando una copa fagocítica.

Eventualmente, las puntas de los seudópodos se fusionan. La dinamina acumulada media la separación de fagosomas de la membrana celular, internalizando los glóbulos rojos opsonizados.

Para la fijación no covalente de los SRBC, vierta 2 mililitros de células opsonizadas con IgG en cada una de las placas recubiertas de polilisina y centrifugue las muestras en una centrífuga de rotor oscilante. Deseche los sobrenadantes y lave las partículas una vez con 2 mililitros de PBS más 10% de BSA.

Luego, incube las partículas con 2 mililitros de PBS fresco más BSA al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de tres lavados con 2 mililitros de PBS. Después del último lavado, reemplace el PBS con 2 mililitros de medio de microscopía sin suero a 37 grados Celsius.

Coloque un plato codificado con SRBC en la platina del microscopio. Luego, raspe las células transfectadas de interés del fondo de la placa de cultivo y pipetee las células varias veces para lograr una suspensión unicelular. Agregue las células transfectadas al plato recubierto con SRBC.

Inicie el software de adquisición en vivo. Encuentre una célula que exprese las proteínas marcadas con fluorescencia y ajuste la posición del plato para que una célula de interés esté en el medio del campo. Adquiera 500 imágenes en diferentes ángulos de 0 a 5 grados en incrementos de 0,01 grados en una longitud de onda de excitación.

Para determinar el ángulo crítico para que la luz incidente se refleje totalmente en la interfaz vidrio-medio y genere una onda evanescente, abra la secuencia de imágenes en el software de imágenes apropiado. Seleccione una región de interés en la célula con fluorescencia uniforme.

A continuación, en la pestaña Imagen, seleccione Pilas y trace el perfil del eje Z. Trazar la intensidad media de fluorescencia del perfil del eje Z medida en la región de interés con la función de los ángulos en el eje X. Cualquier valor de ángulo en el eje x superior al ángulo crítico se puede utilizar durante la sesión de microscopía para obtener una señal TIRF.