Name: Tecnología IgY: Extracción de anticuerpos de pollo de yema de huevo por el polietilenglicol (PEG) Precipitación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprende a extraer anticuerpos IgY de yema de huevo mediante precipitación con polietilenglicol. Este protocolo sencillo y rentable permite obtener altos rendimientos de IgY activa para investigación inmunológica.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención del Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (Proyecto BiGRUDI [Bi ologische efahrenlagen G: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und von I dentifizierung bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Agradecemos a B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie) por su excelente asistencia técnica.

1. Protocolo - IgY-extracción por medio de la precipitación con PEG- Fig. 1 ofrece un diagrama del procedimiento de extracción de IgY (ver Tabla 2). El protocolo fue descrito por primera vez en Polson et al. 1980. Todos los pasos deben realizarse utilizando guantes de látex. <ol><li> La cáscara del huevo es cuidadosamente agrietada y la yema se transfiere a una "cuchara de yema" con el fin de eliminar la mayor cantidad de huevos blancos como sea posible. </li><li> La yema se transfiere a un papel de filtro y rodó a eliminar los restantes clara de huevo, la yema se corta la piel con una lanceta o un instrumento similar (pipeta). La yema se vierte en un tubo de 50 ml y el volumen del huevo está registrado (V1). </li><li> El doble del volumen de yema de huevo de PBS se mezcla con la yema de huevo (ΣV1 + V2), después de PEG 6000 al 3,5% (en gramos, pulverizada) del volumen total se agrega y se agitaron, seguido de 10 minutos rodando sobre una mesa de mezclas de laminación. Ese paso del procedimiento de extracción se separa de la suspensión en dos fases. Una fase consiste en "sólidos en la yema y sustancias grasas" (cita original de Polson et al. 1980) y una fase acuosa que contiene las proteínas IgY y otros. </li><li> Los tubos se centrifuga a 4 ° C durante 20 minutos (10.000 rpm a 13.000 xg de acuerdo, Heraeus Multifuge 3SR +, rotor de ángulo fijo). El sobrenadante (V3) se vierte a través de un filtro de pliegues y se transfiere a un tubo nuevo. </li><li> 8,5% de PEG 6000 en gramos (calculado de acuerdo con el nuevo volumen) se añaden al tubo, vortex y rodó por un mezclador móvil como en el paso 3. </li><li> Repita el paso 4 con la diferencia que se desecha el sobrenadante. </li><li> El pellet es cuidadosamente disuelto en 1 ml de PBS por medio de una varilla de vidrio y el vórtice. PBS se añade a un volumen final de 10 ml (V4). La solución se mezcla con PEG 6000 al 12% (w / v, 1,2 gramos) y se trata como en el paso 3 (vortex, mezclador de rodadura). </li><li> Repita el paso 6 y disolver el precipitado con cuidado en 800 l de PBS (varilla de vidrio y agitar). Espere a que las burbujas de aire a desaparecer y luego transferir (pipeta) el extracto de una cápsula de diálisis. Enjuague el tubo con 400 l de PBS y añadir el volumen de la máquina de diálisis (V5). (Para la preparación de dispositivos de diálisis y de las membranas véase el apéndice). </li><li> El extracto se dializó durante la noche en el 0,1% de solución salina (1.600 ml) y se agita suavemente por medio de un agitador magnético. A la mañana siguiente, la solución salina se sustituye por PBS y se dializó durante otras tres horas. </li><li> Posteriormente, la IgY-extracto sacado de la cápsula de diálisis por una pipeta y se transfirió a tubos de 2 ml. El volumen final es de alrededor de 2 ml (V6). </li><li> El contenido de proteína (mg / mL) de las muestras se mide fotométricamente a 280 nm (1:50 diluido en PBS) y se calcula de acuerdo con la ley de Lambert-Beer, con un coeficiente de extinción de 1,33 para el de IgY (ver fig. 2), Fig. . 4 muestra la calidad de la preparación (la pureza y la recuperación son alrededor del 80%). </li><li> Es recomendable almacenar las muestras en alícuotas a -20 ° C (no congelar las muestras a -70 ° C). </li><li> La calidad de los preparativos finales se analiza mediante una simple SDS-PAGE como se describe en el protocolo JoVe <a href="https://www.jove.com/details.php?id=1916">https://www.jove.com/details.php?id=1916</a> </li></ol> 2. Apéndice antes de usar la bolsa de diálisis debe estar preparado de la siguiente manera de acuerdo a las recomendaciones del fabricante: <ol><li> 20 bolsas de diálisis se cortan en trozos de 30 cm y la da en un vaso de vidrio de 2000 ml. </li><li> 1.750 ml de una mM EDTA 5-solución se agregan. </li><li> Un embudo de vidrio se coloca por encima de las bolsas para asegurarse de que las bolsas están cubiertos por la solución de EDTA. La solución se calienta y se hierve durante 5 minutos (placa caliente). La solución se decanta y las bolsas se lavan tres veces con agua destilada. </li><li> Una vez más, 1.750 ml de solución EDTA se agregan, se hierve durante 5 minutos y se lavan tres veces con agua destilada que el anterior. </li><li> Finalmente las bolsas de diálisis se hierven durante 10 minutos en agua destilada y se almacenan a 4 ° C. Saque las bolsas de diálisis por medio de pinzas esterilizadas. </li></ol> 3. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquema de IgY-extracción por medio de precipitación con polietilenglicol de acuerdo a la descripción original de Polson et al. 1980. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">Para ver una imagen más grande, haga clic aquí.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Desarrollo del total-IgY en la yema de huevo de gallinas inmunizadas en la dependencia de la edad. Teniendo en cuenta es la media semanal del total de IgY / huevo y el SD (n = 4 gallinas ponedoras). A partir de [Pauly et al. 2009]). <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Layicapacidad de control ng de cuatro gallinas inmunizadas con antígenos diferentes. Las flechas indican la fecha de vacunación (de [Pauly et al. 2009]). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">Para ver una imagen más grande, haga clic aquí.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Poliacrilamida-electroforesis en gel de los preparativos IgY individuales a partir de huevos diferentes condiciones reductoras Carril 1 - Marcador de peso molecular, Carril 2 - IgY-estándar, Lane 05.03 - las diferentes muestras IgY preparado como se describe en el protocolo. Estos son los últimos preparativos de acuerdo con el paso 10 del protocolo. HC - cadenas pesadas, LC - CHAINES luz? - Impurezas menores correspondiente al peso molecular alrededor de 35 kDa (probablemente el fragmento C-terminal de la vitelogenina precursor II, [Klimentzou et al, 2006.]). <table border="1"><tbody><tr><td> </td><td> Pollo 21 (un antígeno) </td><td> Pollo 22 (un antígeno) </td><td> Pollo 19 (B antígeno) </td><td> Pollo 23 (C antígeno) </td></tr><tr><td> El número de huevos de gallina (IgY total) 1, 2 años de período </td><td> 625 (38 g) </td><td> 626 (38 g) </td><td> 545 (33 g) </td><td> 608 (37 g) </td></tr><tr><td> Huevo número (IgY total), el primer año </td><td> 345 (20 g) </td><td> 304 (16 g) </td><td> 326 (18 g) </td><td> 308 (17 g) </td></tr><tr><td> Huevo número (IgY total), el segundo año </td><td> 280 (18 g) </td><td> 322 (21 g) </td><td> 219 (15 g) </td><td> 300 (20 g) </td></tr><tr><td> % Del máximo. el número de huevos posibles (primer año) 2 </td><td> 106 </td><td> 93 </td><td> 100 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> % Del máximo. el número de huevos posibles (segundo año) </td><td> 86 </td><td> 99 </td><td> 67 </td><td> 92 </td></tr><tr><td> número de huevos procesados </td><td> 565 </td><td> 620 </td><td> 283 </td><td> 401 </td></tr></tbody></table> 1 La cantidad de IgY total se calcula multiplicando el número de huevos por un valor medio de 60 mg de proteína por huevo de acuerdo a los datos de la Figura 2. 2 the Max. el número de huevos posible por año es de 325 de acuerdo con una información del obtentor. Tabla 1. Dos años de estadísticas de la capacidad de puesta de huevos de gallinas inmunizadas con antígenos diferentes. Acostado en la capacidad por ciento del máximo de cuatro gallinas después de la vacunación con antígenos diferentes, así como el resultado IgY-durante dos años (véase también la fig. 3), [Pauly et al. 2009]). <table border="1"><tbody><tr><td> N º de huevos. </td><td> Hen N º. Fecha de puesta </td><td> V1 [ml] yema </td><td> V2 [ml] PBS </td><td> 1. PEG prec. [G] </td><td> Vol [ml] después de </td><td> 2. PEG prec. [G] </td><td> Bolita </td><td> 3. PEG prec. [G] </td><td> Bolita </td><td> Vol [ml] </td><td> Proteínas totales mg / ml </td><td> Proteína total corregido mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2xV1 ΣV1 + V2 </td><td> 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 </td><td> prec., Centrif. y la filtración V3 </td><td> 8,5% [w / v] V3 </td><td> disuelto en PBS ml V4 </td><td> 12% [w / v] V4 </td><td> Disuelto en PBS ml V5 </td><td> Después de la diálisis contra PBS V6 </td><td> A280/ml </td><td> A280/ml: 1,33 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> H293 / 22.10. </td><td> 15 </td><td> 30 45 </td><td> 1.58 </td><td> 31 </td><td> 2.63 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 35.0 </td><td> 26.3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> H293 / 23.10. </td><td> 13 </td><td> 26 39 </td><td> 1.37 </td><td> 25 </td><td> 2.12 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 28.8 </td><td> 21.6 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Protocolo ejemplar de PEG precipitaciones

<ol><li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li>
<li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Agricult.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li>
<li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly%2C+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li>
<li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+laying+capacity%2C+immunoglobulin+Y+concentration%2C+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li>
<li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li>
<li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchade%2C+R+%22Chicken+egg+yolk+antibodies%2C+production+and+application+%3A+IgY-Technology%22">Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+egg+yolk+antibodies+%28IgY-technology%29%3A+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Altern.+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li>
<li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li>
</ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlín (H 0069/03).

La elección de un método de purificación de IgY adecuado es influenciado por la escala de purificación (de laboratorio o industrial), la rentabilidad, la tecnología (equipos de laboratorio), y el impacto sobre el medio ambiente (gestión de residuos). Diferentes métodos de extracción de IgY se han revisado en detalle por De Meulenaer y Huyghebaert (2001, para una revisión ver también Schade et al. 2005). En general, estos métodos se pueden dividir en tres grupos principales: <ol><li> Métodos de precipitación: la participación de sulfato de amonio o de sodio, polietilenglicol (PEG), el ácido caprílico y caragenean. </li><li> Los métodos cromatográficos: cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de interacción thiophylic, y la cromatografía de filtración en gel. </li><li> Ultrafiltración. </li></ol> La pureza de un preparado de IgY puede ser aumentado por una combinación de métodos, por ejemplo, la precipitación con PEG se puede combinar con la cromatografía de afinidad. En algunos casos, dependiendo de la aplicación final, un extracto de agua de la IgY es suficiente para lograr buenos resultados (Akita y Nakai, 1993). De acuerdo con nuestra experiencia, la IgY de la muestra se obtiene por la precipitación con PEG-funcionó muy bien en un montón de diferentes ensayos inmunológicos. Al estandarizar el método de precipitación con PEG-un asistente técnico es capaz de procesar aproximadamente 84 huevos por semana, lo que corresponde a una cantidad de IgY total entre 4 y 7 g por semana. Un simple cálculo: una gallina ponedora está inmunizado con un antígeno. Después de un impulso pocas vacunas de la gallina produce anticuerpos específicos (Ab) con un título de 1:50.000 durante un período de 30 días. 30 huevos x 2 ml de extracto de IgY (véase el protocolo y la figura. 3) corresponde a 60 ml IgY total, que a su vez corresponde a un Ab-dilución de 3.000 l (la capacidad de un cubo es de 10 l), es decir, con 3.000 l de la solución de Ab 300 cubos se pueden llenar. Por lo tanto, en vista de tan enorme cantidad de Ab-no es un problema de almacenar un Ab-piscina de calidad constante y la especificidad. Esta técnica reduce la variabilidad de carga / mucho de lo contrario observado en poliespecífico Ab. A pesar del aspecto de la cantidad, la IgY Ab tienen más ventajas en comparación con los mamíferos IgG: No activación del sistema de complemento mamífero, sin reactividad cruzada con HAMA (anticuerpos humanos anti-ratón), el factor reumatoide o los antígenos de grupo sanguíneo (falta de heteroagglutinins). Una ventaja sobresaliente de IgY-Ab es la distancia filogenética llamada. Distancia filogenética es la razón de las diferencias describe con frecuencia entre las especificidades Ab de mamíferos y aves, aunque de forma idéntica inmunizados. Además de las diferencias entre los mamíferos y el sistema inmunitario aviar sí mismos, las diferencias en el desarrollo filogenético de estas dos clases de animales contribuye a las diferentes especificidades Ab. Varios autores han reportado que los pollos a menudo producen Acs contra filogenéticamente muy conservadas proteínas o péptidos de mamíferos más eficientemente que los conejos (para revisión ver Schade et a. 2005). Como consecuencia, un antígeno conservado puede permanecer &quot;oculta&quot; para el sistema inmune de conejo, y por lo tanto la única causa una debilidad o una respuesta &quot;en silencio&quot;. Además, si los pollos y los conejos son inmunizados con el antígeno de mamíferos mismo, muy a menudo los pollos responden con un Ab-especificidad que rara vez se puede lograr en los conejos. También el aspecto de la protección de los animales es importante ya que el Ab son de forma no invasiva extraída de la yema de huevo. En combinación con (plásmido) Gene-Gun de vacunación del IgY-producción es completamente no invasivo (Witkowski et al. 2009). En conclusión, la producción de Ab en las gallinas y la extracción de IgY-por medio de PEG-precipitación es muy rentable y los resultados de Ab muy específicas con títulos estables hasta 1:1.000.000. Debido a la distancia filogenética entre Aves y Mamíferos, pollo son capaces de producir Ab específica contra los antígenos altamente conservados de mamíferos, en contraste con los conejos, por ejemplo. La extraordinaria cantidad de Ab obtenidos por la tecnología IgY-abre la puerta también para el uso de IgY-Ab en la medicina humana y veterinaria con fines terapéuticos y / o profiláctico.

<ol><li> Dializa Visking bolsa, tipo 27/32, corte -14 kD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania </li><li> Tubos Falcon Blue Max, 50 ml de polipropileno tubo cónico, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes NY, EE.UU. </li><li> Filtro plegado MN 615 ¼, ∅ 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania Heraeus </li><li> Agitador magnético, Variomag Mono, H + P Labortechnik AG, Oberschleißheim, Alemania </li><li> Micro-dializa-Cápsula de 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania </li><li> Multifuge 3SR +, Thermo Scientific, Langenselbold, Alemania </li><li> Fotómetro UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Alemania </li><li> Polietilenglicol 6000, Rotipuran F. Eur., Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania </li><li> Premezclado PBS-Buffer 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania </li><li> Roller Mixer SRT2, Stuart, Staffordshire, Reino Unido </li><li> Vibrofix VF2, Janke y Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen i.Br., Alemania </li><li> Cuchara de yema de huevo, Fackelmann (efectos Electricidad, gas), Alemania </li></ol>

tecnología igy: extracción de anticuerpos de pollo de yema de huevo por el polietilenglicol (peg) precipitación

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Las gallinas pueden ser inmunizados a través de im vacunación (Musculus pectoral izquierda y derecha, el volumen de inyección de 0,5-1,0 ml) o por medio de la Gene-Gun plásmido de la vacunación. Depende de la inmunogenicidad de los antígenos, anticuerpos altos títulos (hasta 1:100.000 - 1:1.000.000) se puede lograr después de sólo uno o 3-4 vacunas impulso. Normalmente, la gallina de los huevos de forma continua durante aproximadamente 72 semanas, a partir de entonces la imposición de reducciones de capacidad. Este protocolo describe la extracción de IgY total de yema de huevo por medio de un procedimiento de precipitación (PEG. Polson et al. 1980). El método consiste en dos pasos importantes. El primero es la eliminación de los lípidos y el segundo es la precipitación de la IgY total del sobrenadante de un solo paso. Después de la diálisis contra un tampón (normalmente PBS) de la IgY a extraer puede ser almacenado a -20 ° C durante más de un año. La pureza del extracto es de alrededor de 80%, el total de IgY por huevo varía de 40-80 mg, dependiendo de la edad de la gallina ponedora. El incremento total de IgY contenido con la edad de la gallina de alrededor de 40 mg / huevo hasta 80 mg / huevo (en relación con PEG precipitaciones). La capacidad de colocación de una gallina por año es de alrededor de 325 huevos. Eso significa una cosecha total potencial de 20 g IgY total / año en base a un contenido de IgY media de 60 mg total de IgY de huevos / (ver Tabla 1).

Este protocolo describe en particular la extracción de IgY total de yema de huevo por medio de precipitación con polietilenglicol y ofrece información general acerca de la tecnología IgY.

Tecnología IgY: Extracción de anticuerpos de pollo de yema de huevo por el polietilenglicol (PEG) Precipitación

Las gallinas pueden inmunizarse mediante vacunación i.m. (Musculus pectoralis, izquierdo y derecho, volumen de inyección 0,5-1,0 ml) o mediante Gene-Gun...

Este video mostrará el aislamiento de anticuerpos IGY a partir de gallinas, que pueden inmunizarse con el gen de la goma, plásmido, o de forma más tradicional mediante inyección intramuscular. Primero, se aísla la yema del huevo. Luego, se precipitan los lípidos, seguido de una precipitación de una fracción proteica que contiene los anticuerpos, los cuales se aíslan en una etapa adicional de precipitación.Finalmente, los anticuerpos se dializan frente a PBS. Sí. Hola. Mi nombre es Ard. Ese es mi colega, Adema, y trabajamos aquí en el muy antiguo y famoso Instituto de Farmacología, que pertenece a la Medicina Universitaria de SHA de Berlín.Y a continuación, nos gustaría mostrarle la extracción de IGY a partir de huevo de gallina, yogur y un método que consideramos muy, muy simple y también muy rentable. En conjunto, esto pertenece a la llamada tecnología IGY. El primer paso en la preparación de IGY es el aislamiento de la yema de huevo.Para este procedimiento, necesitamos gradillas para tubos, papel de filtro con tapas azules, puntas de pipeta, tampón, un vaso de precipitados de vidrio, una cuchara para separar la yema de la clara del huevo y, por supuesto, los huevos. Se rompe el huevo sobre la cuchara para yemas para liberar la clara. Luego, se agita suavemente la cuchara que contiene la yema para eliminar la mayor parte de la clara del huevo.La yema se traslada entonces al papel filtro para eliminar las proteínas de clara de huevo tan completamente como sea posible. La membrana de la yema es muy estable en huevos, siempre que no tengan más de un mes de almacenamiento; si se almacenan más de tres meses, la estabilidad disminuye. La membrana de la yema puede romperse debido al proceso de envejecimiento durante la manipulación sobre el papel filtro.Posteriormente, la membrana del vitelo se abre con la punta de una pipeta y se transfiere a un tubo. Finalmente, se observa que el vitelo tiene un volumen de aproximadamente 15 mililitros. Ese volumen es normal para una gallina ponedora adulta y varía solo mínimamente.Se registra el volumen de la yema. Se utiliza polietilenglicol al 3,5 % como agente precipitante en tampón PBS para separar las proteínas de la yema, incluyendo la IGY, de los lípidos presentes en la yema del huevo. Se pesan 1,58 gramos de polietilenglicol, lo que corresponde al 3,5 % del volumen final de la yema y del tampón, utilizando una balanza. Los 15 mililitros de yema se mezclan con el doble de volumen de tampón PBS, por lo que se añaden 30 mililitros de PBS, obteniéndose un volumen final de 45 mililitros. A continuación, se añade el polietilenglicol a la mezcla.El tubo se tapa y luego se mezcla en vórtex durante 20 a 30 segundos. Invierta periódicamente el tubo durante el procedimiento de vórtex.Después de agitar en vórtex, la yema debe estar completamente en suspensión. Ahora se colocan los tubos en un mezclador rotatorio durante 10 minutos. El resultado es una mezcla homogénea con un cambio de color de amarillo a amarillo claro.Ahora la mezcla se centrifuga durante 20 minutos. La centrifugación separa un sobrenadante claro que contiene IGY y otras proteínas de un precipitado amarillo, que consiste principalmente en lípidos. En el siguiente paso, el sobrenadante se vierte a través de un filtro plegado y se transfiere a un nuevo tubo.Se registra el nuevo volumen y se descarta el precipitado. Ahora, nuevamente, se agrega polietilenglicol al sobrenadante en una concentración final del 12%, lo que significa 3,5% en la primera precipitación más 8,5% del volumen resultante del SNAT, obteniendo un 12%. Posteriormente, la solución se agita, se incuba en un mezclador rotatorio como antes y se centrifuga durante 20 minutos. Ahora, el polietilenglicol precipita la IGY y otras proteínas.Después de este paso de centrifugación, el precipitado se utilizará en la preparación para la disolución. Los palillos de vidrio del precipitado se desinfectan con etanol al 70 %; mientras los palillos se secan, se descarta el sobrenadante S. Luego, se invierte el tubo para eliminar el resto del sobrenadante.Se añade entonces un mililitro de PBS al precipitado. El precipitado se disuelve utilizando la varilla de vidrio mientras se mezcla mediante vortexaje completo. Ahora se observa una solución ligeramente amarilla.Ahora, se añade PBS hasta un volumen final de 10 mililitros, seguido de una tercera precipitación con polietilenglicol en una concentración del 12 %, como antes, en contraste con la segunda centrifugación. Esta vez se obtiene un precipitado blanco tras la centrifugación durante 20 minutos. El botón se disuelve de la misma manera que antes, pero en dos pasos.En el primer paso, se disuelve en 0,8 mililitros de PBS y se transfiere a una cápsula de microdiálisis. Luego, el tubo se enjuaga con 0,4 mililitros adicionales de PBS, que también se transfieren a la cápsula. En el siguiente paso, se corta una bolsa de diálisis con tijeras desinfectadas y se enjuaga con agua destilada.La bolsa de diálisis se coloca luego en la parte inferior de la cápsula y se cierra firmemente con la parte superior. Finalmente, las cápsulas se transfieren a un vaso de precipitados de vidrio colocado sobre un agitador magnético. La solución de IGY se dializa durante la noche frente a solución salina al 0,1%.Al día siguiente, la solución de IGY se dializa durante tres horas frente a PBS. Una vez finalizada la dialisis, se perfora la membrana de diálisis con la punta de una pipeta y se extrae la solución de IGY, transfiriéndola a un tubo pequeño. Se registra el volumen final.El producto final es una solución clara, que puede almacenarse a menos 20 grados Celsius durante varios años. Según nuestra experiencia, no almacene la preparación de IGY a menos 70 grados Celsius, ya que observamos una pérdida significativa de actividad a esta temperatura. Bueno, esperamos haber logrado convencerle de que la extracción de IDY a partir de una es un procedimiento realmente sencillo y eficaz al seguir nuestro protocolo.El equipo necesario es mínimo, y creemos que existe una relación adecuada entre esfuerzo y beneficio. Espero que esta publicación en video los anime a aprovechar bien nuestro protocolo, así como la tecnología, tal como lo haré yo. Gracias.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, demostramos la inmunoprecipitación de fosfopéptidos basada en anticuerpos a partir de una mezcla de péptidos. Los fosfopéptidos enriquecidos se concentran al vacío y se almacenan para su análisis posterior.

Enriquecimiento de fosfopéptidos: una técnica de inmunoprecipitación basada en anticuerpos para separar péptidos fosforilados específicos de mezclas de péptidos complejos

Este video muestra un ensayo para purificar anticuerpos monoclonales a partir de líquido de cultivo celular recolectado de células de ovario de hámster chino. Emplea una resina de vidrio porosa con proteína A inmovilizada, que se une a la región Fc de los anticuerpos en la muestra, separándolos efectivamente de los contaminantes. El uso de un tampón de elución de pH bajo debilita la interacción, facilitando la recuperación de anticuerpos purificados.

Una técnica para purificar anticuerpos monoclonales producidos por células de ovario de hámster chino

La identificación de moléculas asociadas con regiones genómicas específicas de interés es necesaria para comprender los mecanismos de regulación de las funciones de estas regiones. Este protocolo describe los procedimientos para realizar la inmunoprecipitación de cromatina mediada por moléculas de unión al ADN (enChIP) para la identificación de proteínas y ARN asociados con una región genómica específica.

El aislamiento de regiones genómicas específicas e identificación de moléculas asociadas por enChIP

La oligomerización del receptor de rianodina, un canal iónico homotetrámero que media la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares, es fundamental para la contracción del músculo esquelético y cardíaco. Aquí, presentamos métodos complementarios in vivo e in vitro para detectar la autoasociación de proteínas y determinar la estequiometría de homooligómeros.

Los enfoques genéticos y bioquímicos para<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluación de la oligomerización de proteínas el receptor de rianodina Estudio de caso

El método de Purificación por Afinidad en Tándem (TAP) se ha utilizado ampliamente para aislar complejos nativos de extractos celulares, principalmente eucariotas, para proteómica. Aquí, presentamos un protocolo de método TAP optimizado para la purificación de complejos nativos para estudios estructurales.

Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity

Este método proporciona un marco para el estudio de la incorporación de ácidos grasos exógenos de fuentes huésped complejas en membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para lograrlo, se describen los protocolos para el enriquecimiento de partículas de lipoproteínas a partir de la yema de huevo de pollo y el posterior perfilado de ácidos grasos de fosfolípidos bacterianos utilizando espectrometría de masas.

Aislamiento de partículas de lipoproteínas de yema de huevo de pollo para el estudio de la incorporación de ácidos grasos patógenos bacterianos en fosfolípidos de membrana

Este artículo informa de un método simple para aislar las subcapas perivitellina externa e interna de huevos de pollo mientras se minimiza la alteración estructural y para optimizar la solubilización proteica de cada subcapa para análisis proteómicos.

Separación mecánica y solubilización proteica de las subcapas perivitellina externa e interna de los huevos de gallina

El patrón de glicosilación de un anticuerpo determina su rendimiento clínico, por lo que persisten los esfuerzos industriales y académicos para controlar la glicosilación. Dado que las campañas típicas de glicoingeniería requieren mucho tiempo y mano de obra, la generación de un protocolo rápido para caracterizar el impacto de los genes de glicosilación utilizando silenciamiento transitorio resultaría útil.

Glicoingeniería rápida de anticuerpos en células de ovario de hámster chino

Este protocolo describe una metodología para la preparación de perlas de látex para ensayos con anticuerpos IgY para la detección de antígenos.

Estandarización de un ensayo citométrico de perlas basado en anticuerpos de yema de huevo

Las interacciones proteína-proteína son importantes para dilucidar la función de las proteínas diana, y la coinmunoprecipitación (co-IP) puede confirmar fácilmente los IBP. Transfectamos transitoriamente un plásmido que codifica una proteína marcada con un epítopo en células HEK-293 y desarrollamos un método de inmunoprecipitación para confirmar fácilmente la unión de dos proteínas objetivo.

Inmunoprecipitación con un gel de afinidad anti-epítopo para estudiar las interacciones proteína-proteína

Aprende a extraer anticuerpos IgY de yema de huevo mediante precipitación con polietilenglicol. Este protocolo sencillo y rentable permite obtener altos rendimientos de IgY activa para investigación inmunológica.

Tecnología IgY: Extracción de anticuerpos de pollo de yema de huevo por el polietilenglicol (PEG) Precipitación

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