Generación de variantes de escape del virus de la influenza contra anticuerpos neutralizantes

Tome una suspensión del virus de la influenza, que contenga cepas de tipo salvaje y mutantes.

Una glicoproteína de la envoltura viral denominada hemaglutinina, o HA, se une al ácido siálico en la superficie de la célula huésped, mediando la entrada viral.

Agregue un anticuerpo neutralizante en concentraciones decrecientes que se une al HA, bloqueando el sitio de unión del ácido siálico.

Las cepas mutantes, portadoras de mutaciones en el HA que ayudan a evitar la neutralización de anticuerpos, se denominan variantes de escape.

Inyecte la mezcla en huevos de gallina embrionados libres de patógenos, administrando los virus en el líquido alantoideo e incube.

Los virus neutralizados por anticuerpos no pueden ingresar a las células de la membrana corioalantoidea. Los virus mutantes no neutralizados ingresan a las células, se replican y se liberan en el líquido alantoideo.

Recolecte el líquido alantoideo que contiene la población del virus.

Introducir un anticuerpo específico de HA en concentraciones decrecientes, que neutraliza las otras cepas excepto las variantes de escape.

Introducir glóbulos rojos de pollo o glóbulos rojos. Las variantes de escape no neutralizadas se unen a las células, lo que provoca la aglomeración de glóbulos rojos, lo que se denomina hemaglutinación, lo que confirma la generación de variantes de escape.

Los anticuerpos neutralizantes que tienen actividad HI se analizan más a fondo preparando primero 4 diluciones del anticuerpo de interés en concentraciones crecientes en 1 veces PBS en un volumen de 100 microlitros por dilución. A continuación, prepare un stock de virus de 1 millón de unidades formadoras de placa por mililitro en 1 vez PBS en un volumen de 400 microlitros.

Luego, mezcle 100 microlitros de 1 millón de unidades formadoras de placa por mililitro de virus con 100 microlitros de cada dilución de anticuerpos o 100 microlitros de 1 vez PBS. Incube las muestras durante una hora en una incubadora a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%.

Después de un vórtice breve, inyecte 200 microlitros de cada mezcla en huevos de gallina embrionados libres de patógenos específicos. Luego, incube los huevos a 37 grados centígrados sin dióxido de carbono durante 40 a 44 horas. Después de la incubación, sacrifique los huevos embrionados infectados infectados por el virus colocándolos a 4 grados centígrados durante un mínimo de 6 horas. A continuación, recolecte el líquido alantoideo de los huevos como se describió anteriormente.

Finalmente, confirme las variantes de escape realizando el ensayo HI como se describe en el protocolo de texto.