Un ensayo basado en células para evaluar la absorción de la proteína Tau por la microglía

Comience con una placa de fondo plano de múltiples pocillos que contenga microglía murina adherida: células fagocíticas en el cerebro.

Introducir un medio sin suero que contenga inmunocomplejos. Estos complejos consisten en anticuerpos unidos a agregados de proteína Tau fosforilados, que se forman durante ciertas enfermedades neurodegenerativas.

Los agregados Tau están etiquetados con un tinte fluorescente verde sensible al pH.

Durante la incubación, estos inmunocomplejos interactúan con los receptores Fc de las células microgliales, facilitando su engullimiento.

Este endosoma que contiene inmunocomplejos se fusiona con un lisosoma, formando un endolisosoma. El ambiente ácido del endolisosoma hace que las moléculas de colorante sean fluorescentes.

Lavar para eliminar los inmunocomplejos no internalizados.

Tratar con solución de tripsina-EDTA para desprender las células.

Transfiera la suspensión celular a una placa inferior en U colocada sobre hielo para estabilizar el endolisosoma. Granular las células y desechar el sobrenadante.

Lave y vuelva a suspender las celdas con tampón FACS.

Usando FACS, identifique las células vivas individuales y cuantifique la intensidad de fluorescencia verde para evaluar la absorción de Tau por la microglía.

El primer día del experimento, prepare las células BV-2 lavándolas primero con 1x PBS en el matraz en el que se han cultivado. Luego, incubarlos con tripsina EDTA al 0,05% a 37 grados centígrados y CO₂ al 5% hasta que se desprendan del matraz. Vuelva a suspender las células en el medio de cultivo pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces.

Cuente las células y prepare una suspensión celular con una concentración final de 100.000 células por mililitro en medio de cultivo que contenga 200 microgramos por mililitro de heparina. Agregue 250 microlitros de esta suspensión celular por pocillo en una placa de fondo plano de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Incube la placa a 37 grados centígrados con un 5% de CO₂ durante la noche.

Después de descongelar los agregados de colorante de pH Tau previamente preparados en hielo, diluirlos en 65 microlitros por condición de medio sin suero para hacer una solución de 500 nanomolares. Diluir los anticuerpos en 65 microlitros de medio sin suero para lograr el doble de la concentración deseada. Mezcle los agregados de colorante de pH y Tau y los anticuerpos en una placa de fondo en U de 96 pocillos. Selle esta placa de dilución e incube durante la noche a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, retire el medio de la placa de 96 pocillos con celdas BV-2. Lave las células en cada pocillo con 100 microlitros de temperatura ambiente 1x PBS. Retire el PBS de la placa de celda BV-2. Utilice una pipeta multicanal para transferir 125 microlitros de inmunocomplejos desde la placa de dilución a cada pocillo de una placa celular BV-2 de 96 pocillos e incube durante dos horas a 37 grados centígrados con un 5% de CO₂.

Después de la incubación, retire los inmunocomplejos de las células y lave las células en cada pocillo con 100 microlitros de temperatura ambiente 1x PBS. Después de retirar el 1x PBS, agregue 50 microlitros de tripsina-EDTA al 0,25% e incube durante 20 minutos a 37 grados Celsius con 5% de CO₂. Después de eso, agregue 200 microlitros de medio de cultivo y vuelva a suspender el pocillo pipeteando hacia arriba y hacia abajo para separar las células.

Transfiera las células a una placa de fondo en U de 96 pocillos y centríquela a 400 veces g durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Coloque el plato sobre hielo y retire el medio. Agregue 150 microlitros de PBS helado 1x y centrifugue nuevamente a 400 g durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Coloque el plato en hielo y lávelo nuevamente quitando 1x PBS previamente agregado y agregando 150 microlitros de PBS helado por pocillo. Centrifugar de nuevo en las mismas condiciones.

Coloque la placa en hielo y lave las células retirando el PBS previamente agregado y agregando 150 microlitros de tampón FACS por pocillo. Centrifugar nuevamente a 400 g durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Coloque la placa en hielo, retire el tampón FACS previamente agregado y vuelva a suspender las celdas en 200 microlitros de tampón FACS por pocillo. Proceder inmediatamente al análisis por parte de FACS para adquirir 20.000 eventos en la puerta de células vivas.