Los ensayos biofísicos investigará las propiedades mecánicas del núcleo celular Interfase: Aplicación del sustrato deformación y manipulación de Microneedle

El objetivo general de los siguientes experimentos es medir las propiedades mecánicas de la interfaz del núcleo celular y su conexión física con el citoesqueleto circundante. Esto se logra aplicando una tensión mecánica a células sembradas sobre una membrana de silicona transparente e imagenando las deformaciones nucleares inducidas. Las deformaciones nucleares incrementadas corresponden a una disminución de la rigidez nuclear, ya que los cambios en el acoplamiento nucleo-citoesquelético también pueden influir en las deformaciones nucleares inducidas.

La transmisión de fuerzas intracelulares entre el citoesqueleto y el núcleo se analiza directamente mediante la aplicación de una deformación localizada al citoesqueleto. A continuación, se obtienen imágenes del desplazamiento de estructuras nucleares NU y del citoesqueleto marcadas con fluorescencia. Los resultados muestran la rigidez de los núcleos celulares en relación con el citoesqueleto circundante.

Basándose en experimentos con tensión del sustrato, el ensayo de manipulación con micropunzones revela que la interrupción del acoplamiento núcleo-citoesquelético provoca defectos en la transmisión de fuerzas intracelulares. La principal ventaja de estas técnicas frente a métodos existentes como la aspiración con micropipeta de núcleos aislados es que permiten la medición de la mecánica nuclear en células vivas intactas sin perturbar la arquitectura celular normal. Estos métodos pueden proporcionar información sobre cómo los cambios en la composición de la envoltura nuclear pueden influir en las propiedades mecánicas del núcleo.

También pueden aplicarse para estudiar el papel de la mecánica nuclear en el contexto de enfermedades como las neuropatías por LA o el cáncer. Cada placa de estiramiento consiste en una placa plástica sin fondo, hecha a medida, con un diámetro de tres pulgadas y un anillo O de plástico para sostener una membrana de silicona, que sirve como sustrato para el cultivo celular. Para la preparación de la placa de estiramiento, sujete firmemente entre un anillo O y la placa un trozo de membrana de silicona de cuatro pulgadas por cuatro pulgadas, corte con cuidado el exceso de membrana, enjuague la placa de estiramiento con agua desionizada y luego autoclave la placa antes de recubrir la membrana de silicona con moléculas de matriz extracelular; marque un punto de referencia en la parte exterior de la membrana, en el centro del fondo.

Este punto de referencia ayudará a identificar las mismas células durante los experimentos de tensión para la aplicación de tensión uniaxial. Se colocan dos tiras paralelas de cinta adhesiva alrededor del punto de referencia para restringir la formación de la membrana en una dimensión. Para lograr una óptima adhesión celular, recubra las membranas de silicona con tres microgramos por mililitro de fibronectina o cualquier proteína adecuada de la matriz extracelular.

Cubra el cultivo con una placa invertida de poliestireno de 10 centímetros e incúbela durante la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente. Enjuague la membrana una vez con PBS para eliminar el exceso de proteína. Llene la placa con 10 mililitros de medio de crecimiento y déjela aparte.

Una vez que se ha preparado el platillo con membrana de silicona recubierta, se tratan las células con tripsina al 0,05 % y se siembran células adherentes en el platillo, en medio de crecimiento. Este procedimiento se demuestra con embriones de ratón.

Los fibroblastos o las células mes incuban durante 24 a 48 horas en condiciones normales de cultivo. Un microscopio invertido equipado para experimentos de tensión del sustrato incluye un dispositivo de tensión compuesto por una placa base que se ajusta sobre la platina del microscopio. La placa sostiene un platín cilíndrico central, que sirve para aplicar tensión a la sección central de la membrana de silicona.

El dispositivo también tiene una placa móvil que sostiene el recipiente de tensión y puede deslizarse hacia arriba y hacia abajo sobre cuatro pasadores de guía, así como un peso de cinco libras para aplicar una carga. Para visualizar los núcleos, incubar las células en el recipiente de tensión con un microgramo por mililitro de tinción hooked durante 15 minutos a 37 grados Celsius. Tras la incubación, aspirar el medio y reemplazarlo con 15 mililitros de medio de crecimiento sin rojo de fenol con 25 milimolares de heis.

Luego, enrosque el platillo en el soporte del platillo y aplique cuidadosamente grasa alrededor del borde inferior de la membrana de silicona para garantizar el deslizamiento de la membrana a lo largo del platino central. Asegúrese de mantener la sección central de la membrana limpia. Coloque la placa base sobre la platina del microscopio y monte cuidadosamente el soporte del platillo sobre la placa base.

Asegúrese de que, en la posición de reposo inicial, la membrana de silicona del recipiente de tensión descanse flojamente sobre el platino central. A continuación, enfoque la parte inferior de la membrana de silicona y localice el punto de referencia negro central. Este punto servirá como punto inicial para todas las adquisiciones de imágenes y ayudará a localizar las mismas células durante y después del estiramiento.

En esta imagen, el punto central ocupa todo el campo de visión. A partir del borde del punto, ajuste el enfoque para visualizar las células y la parte superior de la membrana de silicona. Localice células bien extendidas con núcleos situados en el centro.

Adquiera una imagen de contraste de fase, que debe enfocarse en el contorno celular y en la membrana de silicona. Luego, adquiera una imagen de fluorescencia de la tinción del gancho nuclear nu, que debe enfocarse en el plano central del núcleo. Después de adquirir imágenes de cinco a 15 células, regrese al punto central.

Aplique lentamente el peso al platillo de tensión para lograr una aplicación uniforme de la tensión. En el centro del platillo. La tensión máxima aplicada al sustrato está limitada por separadores de nailon colocados en los pasadores de alineación vertical tras la aplicación de la tensión; enfoque en la parte inferior de la membrana de silicona y localice nuevamente el punto de referencia, partiendo desde dicho punto.

Reubique las mismas células y adquiera nuevamente una imagen de contraste de fases y de fluorescencia al final en el núcleo de cada célula bajo tensión completa, intentando coincidir lo más posible con los planos focales de las imágenes iniciales. Este proceso no debe exceder los 10 minutos para evitar la remodelación activa y la adaptación de la célula al sustrato extraño. Una vez que se hayan adquirido todas las imágenes correspondientes, mueva la platina del microscopio de vuelta al punto de partida.

Retire cuidadosamente el peso de la placa del soporte del recipiente y permita que la membrana de silicona se relaje, si es necesario. Empuje suavemente hacia arriba el recipiente de tensión hasta que esté en la posición inicial. Luego, adquiera contraste de fase y fluorescencia.

Se analizan imágenes de las células después de la deformación, tal como se describió para las imágenes de la deformación, así como imágenes de células y núcleos marcados con fluorescencia antes, durante y después de la aplicación de la deformación, para calcular la deformación nuclear normalizada. En esta demostración, se utiliza un script personalizado escrito en MATLAB para el análisis, aunque existen varias opciones alternativas para calcular manualmente la deformación aplicada al sustrato, haciendo coincidir las posiciones de tres a seis puntos de control ubicados en la membrana entre las imágenes correspondientes antes y después de la deformación completa. El programa de MATLAB calcula entonces la deformación aplicada a la membrana comparando las posiciones de los puntos de control homólogos entre las imágenes antes de la deformación y con deformación completa.

También se comparan las posiciones para la deformación residual entre las imágenes previas y posteriores a la deformación. Los puntos de control se utilizan simultáneamente para registrar los pares de imágenes, lo que ayudará a detectar células dañadas o en proceso de desprendimiento. A continuación, seleccione manualmente los núcleos mediante un programa MATLAB independiente que calcula la deformación nuclear para cada núcleo individual.

Esto se logra igualando el tamaño nuclear entre las imágenes fluorescentes correspondientes previas y posteriores a la deformación completa, o mediante la coincidencia de marcadores intranucleares para tener en cuenta pequeñas variaciones en la deformación aplicada a la membrana entre diferentes experimentos. Los resultados se expresan como deformación nuclear normalizada. Esto se define como la relación entre la deformación nuclear inducida y la deformación aplicada a la membrana, calculada para cada núcleo.

Los scripts de MATLAB están disponibles a solicitud en el laboratorio de lambing. Como paso final, se valida cada núcleo y se excluyen las mediciones de células que se desprenden o se dañan durante la aplicación de la deformación. Se tomaron imágenes de MEF que se extendieron sobre dos áreas distintas de la membrana de silicona mediante microscopía de contraste de fase y microscopía de fluorescencia antes, durante y después de la aplicación de una deformación axial del 20 %UNI; aquí se muestra un ejemplo de un experimento exitoso con núcleos válidos procedentes de células que sobrevivieron a la aplicación de la deformación sin ningún daño ni desprendimiento.

En contraste, las células mostradas aquí se retrajeron o se desprendieron parcialmente durante la aplicación de la deformación y se excluyen del análisis. La célula en el lado izquierdo muestra signos de daño en el citoesqueleto y colapso nuclear, mientras que la célula en el lado derecho se desprende parcialmente y se retrae durante la aplicación de la deformación. Esto puede ser una indicación de una deformación excesiva.

Aquí se muestra un análisis de la deformación nuclear normalizada en un panel de diferentes líneas celulares de células meth de ratones deficientes en Laminina AC que expresan ectópicamente ya sea un vector vacío o laminina A de tipo salvaje, en comparación con mitos de camadas de tipo salvaje. La pérdida de expresión de las proteínas de la envoltura nuclear, Laminina AC, da como resultado un aumento en la deformación nuclear normalizada. Esto indica una disminución en la rigidez nuclear, lo cual puede restaurarse parcial o completamente mediante la reintroducción de Laminina A de tipo salvaje. Para prepararse para el experimento de manipulación con micropunzón, incubar un plato de cultivo celular de 35 milímetros con fondo de vidrio con una baja concentración de fibronectina durante dos horas a 37 grados Celsius. Tras la incubación, lavar el plato dos veces con HBSS y añadir dos mililitros de medio de crecimiento al plato.

Luego, los fibroblastos embrionarios de ratón se tripsinizan con tripsina al 0,05 % y se siembran en medio de crecimiento sobre un platillo con fondo de vidrio recubierto con fibronectina, en dos mililitros de medio de crecimiento. Para obtener células individuales adherentes no confluentes, coloque las células de nuevo en el incubador durante la noche para teñirlas; agregue el colorante mitocondrial MIT tracker y el colorante nuclear marcado al medio de crecimiento. Añada este medio de crecimiento a las células y proceda con la incubación.

A continuación, lave las células incubándolas en solución salina tamponada con Hank durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego agregue medio de crecimiento sin fenol rojo con 25 milimolar. Agregue la pieza de He a las células para la adquisición de imágenes.

Para el experimento con micropunzones, inserte un micropunzón previamente elaborado en un micromanipulador acoplado a un microscopio invertido con un dispositivo digital acoplado a carga. Enfocar la cámara y el micropunzón cerca de una sola célula. Adquirir una imagen de la célula individual sin que el micropunzón esté insertado en el citoesqueleto.

En contraste de fase, obtenga una imagen fluorescente de la tinción con hooks 3 3, 3 4 2 y una imagen fluorescente de la tinción mitocondrial con un objetivo de 60x en un microscopio invertido utilizando el micromanipulador; inserte cuidadosamente la micropipeta en el citoplasma de una célula a una distancia fija del perímetro nuclear y capture una imagen en contraste de fase, una imagen fluorescente de la tinción con hooks 3 3, 3 4, 2 y una imagen fluorescente de la tinción mitocondrial. Desplace la micropipeta una distancia específica hacia la periferia celular a una velocidad de un micrómetro por segundo, utilizando el micromanipulador controlado por computadora, mientras adquiere automáticamente imágenes cada 10 segundos.

Mientras la micropunción se desplaza una distancia específica hacia la periferia celular, el micro manipulador debe controlarse mediante una computadora para lograr una micro-manipulación consistente. Finalmente, los procedimientos adquieren imágenes después de retirar la micropunción; se analizan las imágenes del citoesqueleto y las características fluorescentemente marcadas del núcleo y del citoesqueleto obtenidas antes, durante y después de la manipulación con micropunción, con el fin de calcular el desplazamiento de pequeñas regiones intracelulares. En esta demostración, se utiliza un script personalizado escrito en MATLAB para el análisis, aunque existen varias otras opciones disponibles.

El script de MATLAB está disponible en el laboratorio de lambing bajo solicitud para medir el desplazamiento generado por la microneedle. El programa de MATLAB utiliza un algoritmo de correlación cruzada normalizada para calcular el desplazamiento entre la ubicación original de las características marcadas con fluorescencia y su posición recién identificada. Luego, los desplazamientos se muestran como mapas vectoriales y se almacenan como valores numéricos.

El siguiente paso consiste en utilizar los mapas resultantes de vectores de desplazamiento para determinar los desplazamientos promedio dentro del citoesqueleto o el núcleo mediante matlab. Primero, seleccione tres o más puntos dentro del citoesqueleto en el sitio de aplicación de la deformación. En el mapa de vectores de desplazamiento, obtenga el valor numérico promedio para determinar la cantidad de deformación del citoesqueleto cerca del sitio de aplicación que se generó durante la aplicación de la micropunzón.

A continuación, seleccione tres o más puntos dentro del núcleo cerca del sitio de aplicación de la deformación y tome el valor promedio. Este valor representa la cantidad de deformación nuclear cerca del sitio de aplicación de la micropunzón. Utilizando el mismo método, determine la deformación nuclear y del citoesqueleto lejos del sitio de aplicación de la deformación, a partir de puntos seleccionados en estas regiones respectivas.

Se realizó un ensayo de manipulación con micropunzones para medir la transmisión de fuerza intracelular. Aquí se muestran imágenes de contraste de fase e imágenes de fluorescencia de un fibroblasto marcado con tinción nuclear azul y tinción mitocondrial verde con rastreador MIT. Se insertó un micropunzón en el citoesqueleto a una distancia definida del núcleo y posteriormente se movió hacia la periferia celular.

El desplazamiento mitocondrial se prolonga antes, durante y después de la tensión del citoesqueleto, y luego los desplazamientos se representaron como vectores. Cada vector representa el desplazamiento calculado como el cambio entre la ubicación original y la posición recién identificada. Las regiones con baja intensidad de imagen o textura insuficiente se excluyeron del análisis.

Luego se cuantificaron el desplazamiento del citoesqueleto y del núcleo en áreas seleccionadas a distancias crecientes desde el sitio de aplicación de la deformación, tanto en fibroblastos de control como en fibroblastos. Cuando existe un acoplamiento nucleo-citoesquelético intacto, las fuerzas se transmiten a través de toda la célula, lo que provoca una deformación inducida del núcleo y del citoesqueleto que se disipa lentamente al alejarse del sitio de aplicación de la deformación. En contraste, las células con acoplamiento nucleo-citoesquelético alterado muestran un desplazamiento localizado cerca del sitio de aplicación y apenas una deformación inducida a mayores distancias.

Se observa una aplicación comparable de tensión citoesquelética en el sitio de inserción de la micropunzón tanto en fibroblastos de control como en fibroblastos con acoplamiento nucleocitoplasmático interrumpido. Sin embargo, el desplazamiento nuclear y citoesquelético inducido en otras regiones fue significativamente menor en los fibroblastos con acoplamiento nucleocitoplasmático alterado que en las células de control. Por lo tanto, una disminución en el desplazamiento citoesquelético y nuclear lejos del sitio de aplicación de la tensión indica que la transmisión de fuerza entre el citoplasma y el núcleo se vio perturbada.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la mecánica nuclear y la transmisión de fuerzas intracelulares entre el núcleo y el citoesqueleto. Puede utilizar estas técnicas para estudiar el efecto de mutaciones en proteínas de la envoltura nuclear o los cambios en la composición de la envoltura nuclear que ocurren durante el desarrollo o en el cáncer.