Aislamiento de linfocitos T asesinos naturales invariantes de un modelo de ratón

Comience inyectando por vía intraperitoneal un glicolípido sintético en un ratón.

Las

células presentadoras de antígenos, o APC, internalizan el glicolípido y lo presentan a través de la molécula MHC no clásica CD1d.

Las APC migran al bazo e interactúan con las células T asesinas naturales invariantes o las células iNKT, induciendo la activación y proliferación de células iNKT.

Cosecha el bazo. Disociarlo mecánicamente para generar una suspensión unicelular.

Transfiera las células a un tubo. Agregue un medio de gradiente de densidad y centrifugue para separar los linfocitos.

Recoge los linfocitos. Agregue tetrámeros CD1d marcados con fluoróforo cargados con antígenos glicolípidos que interactúan con las células iNKT.

Retire los tetrámeros no unidos. Superposición con microperlas magnéticas que se unen a los fluoróforos unidos a tetrámeros.

Retire las perlas sueltas y cargue la suspensión celular en una columna magnética.

Bajo el campo magnético, las celdas iNKT unidas a perlas se retienen en la columna mientras que las celdas restantes fluyen.

Retire la columna del campo magnético. Agregue un tampón de elución para eluir las células iNKT.

Inyectar DBA/1 normal de ratón por vía intraperitoneal con alfa-GalCer, a una dosis de 0,1 miligramos por kilogramo de peso corporal. Tres días después del modelado, después de la anestesia, aislar el bazo del ratón. Prepare una suspensión unicelular cortando y moliendo el bazo en un colador de malla 200. Lave la suspensión celular con PBS. Centrifugar a 200 veces g durante 5 minutos y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender las células con 1 mililitro de solución de dilución de sangre total y tejido. Agregue 3 mililitros de medio de separación de linfocitos de ratón y luego centrifugue las células durante 20 minutos, a 300 veces g, a temperatura ambiente.

Para purificar las celdas iNKT, vuelva a suspender de 10 a 7 celdas con 100 microlitros de PBS de 4 grados Celsius. Agregue 10 microlitros de tetrámero-PE CD1d cargado con alfa-GalCer e incube a 4 grados centígrados durante 15 minutos en la oscuridad. Lave las células dos veces con PBS y vuelva a suspenderlas en 80 microlitros de PBS. Agregue 20 microlitros de microperlas anti-PE e incube a 4 grados centígrados durante 20 minutos en la oscuridad. Lávelos dos veces con PBS y vuelva a suspender las células con 500 microlitros de PBS.

Coloque la columna de clasificación en el campo magnético del clasificador MACS y enjuague con 500 microlitros de PBS. Agregue la suspensión celular preparada a la columna de clasificación, recoja el flujo y enjuague tres veces con tampón PBS. Elimine el campo magnético y agregue 1 mililitro de tampón PBS a la columna de clasificación. Empuje rápidamente el émbolo a una presión constante para introducir las células marcadas en el tubo de recogida y obtener las células iNKT purificadas. Cuente con un contador de células automatizado.