Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 4:21 min. • July 8th, 2025
Tomemos como ejemplo las células asesinas naturales o NK. Agregue vectores de lentivirus que comprenden enzimas virales y moléculas de ARN diseñadas que codifican una proteína fluorescente.
Agregue polímeros catiónicos y sedimente las células y los virus.
Los polímeros neutralizan las cargas negativas tanto en el virus como en la célula, facilitando la fusión de la membrana.
El ARN se transcribe de forma inversa en ADN y se integra en el genoma del huésped, lo que permite la expresión de proteínas fluorescentes.
Agregue medios suplementados con la citocina interleucina-2 o IL-2.
La IL-2 desencadena la señalización intracelular que promueve la supervivencia y proliferación de las células NK al tiempo que preserva la expresión transgénica.
Transfiera la mezcla a un pozo recubierto con anticuerpos que se unen a inmunorreceptores específicos en las células NK, lo que hace que liberen citoquinas antivirales.
Cuantificar las citocinas liberadas para evaluar el impacto del polímero en la producción de citoquinas.
Agregue tintes fluorescentes para etiquetar el ADN de las células necróticas.
Mediante citometría de flujo, identifique células vivas y cuantifique la señal de la proteína fluorescente para medir la eficiencia de la transducción inducida por polímeros.
Suspenda las células NK primarias de ratón o humanas en los pocillos de una placa de 24 pocillos a 0,5 x 105 por mililitro de medio con sobrenadante de lentivirus GFP a un MOY de 5, 10 y 20 y en presencia de polibeno, sulfato de protamina o dextrano.
Centrifugar las placas a 1.000 veces g durante 60 minutos. Luego, sin decantar el sobrenadante, cultive las células en una incubadora a 37 grados Celsius infundida con 5,2% de dióxido de carbono durante la noche. Después de lavar las células con 10 mililitros de PBS, use 2 mililitros de medio RPMI 1640 con IL-2 para volver a suspender las células.
El día antes de recolectar las células, cubra las placas de poliestireno altamente absorbente de proteínas de 96 pocillos con 2,5 microgramos por mililitro de anticuerpos monoclonales anti-NKG2D e incube las placas a temperatura ambiente o en el refrigerador durante la noche. Al día siguiente, use 100 microlitros de PBS para lavar cada pozo tres veces.
Recolecte las células NK transducidas golpeando primero suavemente las placas. Luego agregue 100 microlitros de las células a cada pocillo de las placas de 96 pocillos. De 16 a 18 horas después de la activación, utilice una pipeta multicanal para recoger los sobrenadantes. Luego, usando las citocinas recombinantes de un kit ELISA, genere una curva estándar y cuantifique las citoquinas como el interferón-gamma en el sobrenadante.
Para probar la viabilidad de las células NK, cuatro días después de la transducción, lave las células con 10 mililitros de PBS frío dos veces. Luego, recolecte las células y use una anexina-V/7-amino-actinomicina D para teñirlas. Utilice la citometría de flujo para determinar el porcentaje de células necróticas entre las células NK transformadas y analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto.