Transfección de macrófagos primarios con ARNm modificado

Comience con un tubo que contenga ARNm transcritos in vitro que codifiquen proteínas fluorescentes verdes.

El ARNm contiene nucleótidos modificados, 5-metil-citidina trifosfato y pseudouridina trifosfato, que previenen la respuesta inmune y mejoran la estabilidad del ARNm.

El extremo 5' del ARNm se desfosforila, lo que impide su reconocimiento por los receptores de reconocimiento de patrones en los macrófagos.

Agregue un reactivo de transfección a base de lípidos catiónicos al ARNm, facilitando la encapsulación del ARNm a través de interacciones electrostáticas y formando un complejo.

Introduzca los complejos lípidos-ARNm en una placa de múltiples pocillos con macrófagos primarios derivados de ratones adheridos y agite suavemente para una mezcla uniforme.

Los macrófagos internalizan el complejo que contiene ARNm en un endosoma. Más tarde, el complejo se fusiona con la membrana endosómica, liberando los ARNm en el citoplasma celular.

La cola de poli-A en el extremo 3' estabiliza el ARNm que se somete a la síntesis de proteínas para producir proteínas fluorescentes verdes.

Bajo un microscopio de fluorescencia, la fluorescencia verde dentro de los macrófagos sugiere la transfección exitosa con ARNm modificados.

Prepárese para la transfección agregando el volumen precalculado de tampón de transfección de ARNm menos los volúmenes de reactivo de transfección de ARNm y el ARNm a un tubo de reacción. Descongele el stock de ARNm y mézclelo suavemente volteando el tubo. Luego, agregue el volumen precalculado de ARNm al tubo de reacción.

Agite y centrifugue la mezcla de reacción y el reactivo de transfección de ARNm, luego agregue el volumen apropiado del reactivo de transfección de ARNm al tubo de mezcla de reacción. Agite el tubo, gírelo hacia abajo, luego incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mientras tanto, reemplace el medio de cultivo de los macrófagos con un medio de cultivo fresco y tibio.

Una vez que se complete la incubación de la mezcla de transfección, agregue la mezcla a los pocillos de la placa que contienen los macrófagos gota a gota y en círculo desde el exterior hasta el centro del pocillo. Para garantizar una distribución uniforme de la mezcla de transfección, mueva suavemente la placa en dirección vertical y horizontal.

Luego incube la placa a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante al menos seis horas. Después de la incubación, analice la eficiencia de la transfección con microscopía de fluorescencia, citometría de flujo o inmunotransferencia.

La parte más importante de este procedimiento es garantizar una distribución uniforme de la mezcla de transfección para que todos los macrófagos entren en contacto con la misma cantidad de ARNm.