Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:44 min. • July 8th, 2025
Tome dos cubetas de electroporación. Una cubeta contiene un pequeño ARN interferente, o ARNip, diseñado para inhibir la producción de FIP200, una proteína inductora de autofagia.
La segunda cubeta contiene un siRNA codificado como control que no inhibe la producción de FIP200.
Agregue células dendríticas inmaduras, o iDC; electroporar para la entrada celular de ARNip y luego colocar placas en las células.
El siRNA internalizado se une a un complejo de silenciamiento inductor de ARN.
El complejo con el ARNip específico de FIP200 escinde su ARNm objetivo, inhibiendo la producción de FIP200, mientras que los iDC tratados con ARNip de control producen FIP200.
Recolecte las células y agregue el virus del herpes simple. Tras la fusión de la envoltura viral y la membrana celular, el ADN liberado ingresa al núcleo y conduce a la producción de proteínas virales y nucleocápsides.
Las proteínas virales alteran las láminas nucleares. FIP200 forma un complejo que desencadena una cascada de señalización, induciendo la autofagia de las láminas alteradas para su degradación y facilitando el escape de las nucleocápsidas virales al citoplasma.
La inhibición mediada por ARNip de la producción de FIP200 restringe la autofagia de las láminas, evitando el escape de la nucleocápside.
Las células están listas para evaluar la inhibición de la autofagia inducida por ARNip.
En el día 3.5 después de la adherencia, transfiera 12 millones de iDC a un tubo de 50 mililitros. Centrítelos a 300 veces g durante 5 minutos y luego deseche el sobrenadante. Paralelamente, realice análisis de citometría de flujo para monitorear el estado de maduración.
Lavar suavemente los iDC en 5 mililitros de OptiMEM sin rojo de fenol y centrifugarlos a 300 veces g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 200 microlitros de OptiMEM, ajustando la concentración celular a 6 millones de células por 100 microlitros.
Agregue 75 picamoles de ARNip codificado o específico de FIP200 a cubetas de electrodos de 4 milímetros y transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a la cubeta respectiva. Pulse directamente los iDC utilizando un aparato de electroporación.
Después de la electroporación, transfiera los iDC a placas de seis pocillos con medio DC fresco precalentado, siembrando las celdas a una concentración final de 1 millón de celdas por mililitro, y colóquelas en la incubadora. Después de 48 horas, examine la morfología de los iDC electroporados microscópicamente, luego recolecte las células con un raspador de células y transfiéralas a tubos de 15 mililitros.
Enjuague los pocillos con 1 mililitro de PBS suplementado con EDTA al 0,01% y transfiera la solución a los tubos respectivos. Luego, divida las células para cada condición de ARNip como se describe en el manuscrito.
Utilice 500.000 células para evaluar el estado de maduración y la viabilidad celular. Utilice 1 millón de células para el análisis de Western blot para verificar la eficiencia de eliminación específica de 200 y utilice las células restantes para experimentos de infección por HSV-1.