JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 4:42 min • July 8th, 2025
Tome vectores retrovirales mezclados con células primarias del bazo.
Los vectores contienen ARN transgénico que codifica un receptor de antígeno quimérico o CAR, que se dirige a un antígeno específico del tumor.
La citocina interleucina-2 en el medio promueve selectivamente la proliferación de células T mientras que las otras células finalmente mueren.
Transfiera la mezcla a una microplaca recubierta con fragmentos de fibronectina recombinante.
Centrifugar para facilitar la unión de los fragmentos de fibronectina a los vectores y las células T, mediando la interacción virus-célula huésped, e incubar.
Tras la fusión de la envoltura de los vectores con la membrana celular, las enzimas virales transcriben inversamente el ARN liberado en ADN y lo incorporan al genoma del huésped.
Las células T transducidas expresan CAR unidos a la superficie, que consisten en un fragmento variable de anticuerpo extracelular dirigido al antígeno específico del tumor y a las regiones de señalización intracelular para responder al antígeno.
Vuelva a suspender las células antes de transferirlas a un tubo.
Centrifugar para descartar el sobrenadante que contiene virus no internalizados y volver a suspender las células en un tampón para ensayos posteriores.
El día después de la esplenectomía, prepare PBS que contenga 25 microgramos por mililitro de fragmento de fibronectina humana recombinante o RHFF y cubra placas de 24 pocillos no tratadas con cultivo de tejidos agregando 0,5 mililitros de la solución a cada pocillo. Al día siguiente, retire la solución de los pocillos y agregue 1 mililitro por pocillo de BSA al 2% en PBS.
Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego, retire el BSA volcando firmemente la placa antes de agregar 2 mililitros de PBS al lavado. Después de recolectar el sobrenadante viral de las células HEK293T, agregue TCM fresco a un volumen final en mililitros igual al número de pocillos recubiertos con RHFF más 3 mililitros adicionales.
Retire los esplenocitos cultivados de la incubadora y vuelva a suspenderlos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces en cada pocillo. Transfiera las suspensiones celulares a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, vuelva a suspender los esplenocitos en el sobrenadante viral a 1 x 106 células por mililitro.
Luego, agregue 1 mililitro por pocillo de la suspensión de esplenocitos a los pocillos de las placas recubiertas con RHFF. Ahora, gire las placas durante 90 minutos a 32 grados Celsius y 770 gs con una aceleración de 4 y un ajuste de ruptura de cero. Durante el centrifugado, prepare 50 unidades internacionales por mililitro de IL-2 humana recombinante en MTC.
Después del centrifugado, agregue 1 mililitro del medio a cada pocillo de las placas e incube durante la noche. Si las células T alcanzan una confluencia superior al 80%, divida las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo en cada pocillo, dos o tres veces, luego transfiera 1 mililitro de cada pocillo a nuevos pocillos de una placa fresca tratada con cultivo de tejidos de 24 pocillos.
Agregue 1 mililitro de MTC fresca, con 50 unidades internacionales por mililitro de IL-2 a cada pocillo. Si las células no alcanzan una confluencia superior al 80%, cambie la mitad del medio pipeteando lentamente 1 mililitro de medio de la parte superior de cada pocillo y reemplazándolo con 1 mililitro de MTC fresca, que contenga 50 unidades internacionales por mililitro de IL-2 humana recombinante.
Vuelva a suspender las células T con CAR pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces en cada pocillo y transfiéralas a un tubo de centrífuga de 250 mililitros. Centrifugar las células a 300 gs durante 10 minutos. A continuación, aspire completamente el sobrenadante sin alterar el sedimento. Use PBS para lavar las células, luego cuéntelas antes de lavarlas por segunda vez. Un rendimiento típico de células T con CAR es de aproximadamente 1 x 106 células por pocillo.