JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 2:30 min • July 8th, 2025
Tomemos las células T suspendidas en un medio adecuado para la electroporación, un proceso en el que los pulsos eléctricos crean poros temporales en la membrana celular.
Agregue complejos que contengan una proteína Cas9 y un solo ARN guía o sgRNA. El sgRNA es un ARN pequeño que dirige Cas9, una tijera molecular, a una ubicación específica en el ADN para cortarlo.
Agregue moléculas cortas de ADN monocatenario que ayuden a transportar los complejos Cas9-sgRNA a la célula.
Transfiera esta mezcla a una cubeta e inicie la electroporación aplicando breves pulsos eléctricos.
Este proceso permite que los complejos entren en la célula.
El sgRNA se une al sitio objetivo en el ADN de las células T, lo que permite a Cas9 editar el ADN, creando una ruptura en ambas hebras.
Esta interrupción envía señales a las proteínas de reparación al sitio.
Luego, las proteínas de reparación vuelven a conectar los extremos, lo que hace que el gen no funcione.
Incube las células T editadas genéticamente en un medio adecuado para ensayos posteriores.
Prepare la ribonucleoproteína, o complejo RNP, incubando 10 microgramos de nucleasa Cas9 con 5 microgramos de ARN guía único durante 10 minutos a temperatura ambiente. Incluya un control simulado sin ARN guía único. Combine las células T resuspendidas con el complejo RNP y agregue 4,2 microlitros de 4 potenciadores de electroporación micromolar. Mezclar bien y transferir a cubetas de electroporación.
Galvanizar las celdas usando el código de pulso EH-1-11. Luego, incube 5 millones de células por mililitro en R-10, complementadas con cinco nanogramos por mililitro de IL-7 humana e Il-15 humana a 30 grados Celsius durante 48 horas en placas de 12 pocillos. Después de la incubación, proceda con la activación y expansión de las células T.