Generación de un modelo de ratón BLT (médula ósea, hígado, timo) doblemente humanizado

Comience con un ratón anestesiado e inmunodeficiente que carece de células inmunitarias.

Trate al ratón con una dosis subletal de rayos X para eliminar las células madre existentes de la médula ósea.

Diseccionar el ratón y administrar fragmentos de hígado fetal humano y tejido del timo entre el riñón y su cápsula.

Cierre la incisión.

El hígado implantado y el tejido del timo crecen, formando organoides, que son agregados celulares que se asemejan a un órgano.

Después de la recuperación, inyecte células madre hematopoyéticas humanas o HSC en la vena de la cola.

Las HSC inyectadas migran al organoide del timo y la médula ósea, diferenciándose en varias células inmunitarias humanas.

Proporcione agua suplementada con antibióticos al ratón para matar los microbios intestinales existentes.

Usando un tubo oral, introduzca microbios fecales humanos directamente en el intestino del ratón para promover la colonización microbiana.

Esto da como resultado el desarrollo de un modelo de ratón BLT doblemente humanizado con un sistema inmunológico humano y microbios intestinales.

Para implantar los tejidos del hígado y el timo en la cápsula renal izquierda, primero, coloque al ratón en una capucha. El día de la cirugía, trate a los ratones con irradiación subletal de todo el cuerpo a una dosis de 12 centi-gray por gramo de peso corporal. Afeite cada ratón alrededor del lado lateral izquierdo y medial después de confirmar un nivel adecuado de sedación. Aplique ungüento oftálmico en los ojos del animal, aplique una marca auricular según sea necesario y desinfecte la piel con tres exfoliantes secuenciales de yodo e isopropanol al 70%.

Cuando se haya preparado la piel, use fórceps para cargar un fragmento de tejido hepático fetal humano de 1 a 1,6 milímetros cúbicos en un trócar, seguido de un fragmento de tejido del timo fetal humano de 1 a 1,6 milímetros cúbicos. Use las pinzas para levantar la piel y use un bisturí para hacer un pequeño corte longitudinal en la piel. Extienda el corte a 1,5 a 2 centímetros en el lado izquierdo del mouse y use fórceps para levantar la capa muscular. Use tijeras para abrir la capa muscular longitudinalmente, extendiendo el corte según sea necesario, para exponer el riñón y agarre suavemente el tejido graso que rodea el riñón.

Use un bisturí para hacer una incisión de 1 a 2 milímetros en el extremo posterior de la cápsula renal e inserte lentamente el trócar precargado en la incisión, paralelo al eje largo del riñón. Liberar los tejidos entre la cápsula del riñón y el riñón, y devolver el riñón y el intestino a sus posiciones normales. Luego, use suturas para cerrar la capa muscular y grapas quirúrgicas para cerrar la piel. Coloque el ratón en una jaula microaislada esterilizada en autoclave con monitoreo hasta que esté completamente decúbito. Seis horas después de la cirugía, coloque a los ratones debajo de una lámpara de calor y desinfecte los cuentos con isopropanol al 70%.

Inyecte 1,5 a 5 x 10⁵ células madre hematopoyéticas aisladas de tejido hepático fetal humano CD34 positivo en 200 microlitros de PBS en una vena de la cola dilatada por animal. Luego, detenga cualquier sangrado con una presión suave y devuelva a los ratones a su jaula de origen. De 9 a 12 semanas después de la cirugía, use un cono de plástico de tamaño adecuado para aislar una pierna de un ratón humanizado y rocíe el lado medial de la pierna aislada con isopropanol al 70%. Extienda antibióticos y ungüentos analgésicos en el sitio de recolección.

Con una aguja de calibre 25 sostenida en un ángulo de 90 grados, perfore la vena safena para recolectar de 50 a 100 microlitros de sangre en un tubo de recolección de sangre recubierto de EDTA. Cuando se haya obtenido un volumen adecuado de sangre, aplique presión en el sitio con la gasa estéril para detener el sangrado antes de devolver el ratón a su jaula. Luego, use la muestra de sangre periférica recolectada para evaluar el nivel de reconstitución de células inmunes humanas por citometría de flujo, utilizando anticuerpos contra CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 y CD45 de ratón.

Para la recolección de muestras fecales frescas, coloque bolsas de papel individuales esterilizadas en autoclave en una campana extractora y coloque un ratón en cada bolsa hasta que cada animal defeque. Luego, regrese a los ratones a su jaula y use fórceps estériles para transferir cada muestra fecal a un tubo de 1,5 mililitros por ratón para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius.

Al final del tratamiento antibiótico de 14 días, cambie el agua potable a agua esterilizada esterilizada en autoclave y transfiera los ratones a una nueva jaula esterilizada en autoclave. 24 y 48 horas después del cese de los antibióticos, llene las fuentes de material de trasplante de microbiota fecal debidamente preparadas y alícuotas las muestras en una cámara anaeróbica en condiciones anaeróbicas.

Para realizar un trasplante fecal, administre 200 microlitros de material de trasplante de microbiota fecal por sonda oral a cada animal experimental y esparza el material descongelado restante en el pelaje de los ratones humanizados o en la ropa de cama de la jaula.