Generación de una vacuna multivalente contra vesículas de membrana externa

Tomemos poliplex de transfección que contienen plásmidos diana unidos a un polímero. Los plásmidos codifican un antígeno viral fusionado con una etiqueta peptídica y una etiqueta de afinidad.

Incubar los poliplex con células de mamíferos, que internalizan los poliplexos dentro de los endosomas.

El polímero induce la ruptura de la vesícula. Los plásmidos liberados expresan el antígeno viral, que se secreta extracelularmente.

Coseche el sobrenadante que contiene el antígeno y los contaminantes. Agregue un agente competidor a baja concentración.

Cárguelo en una columna de cromatografía de afinidad.

Las etiquetas de afinidad se unen a la resina de la columna, inmovilizando el antígeno, mientras que el agente competidor disminuye la unión no específica.

Fluya el agente competidor a baja concentración, eliminando los contaminantes débilmente unidos.

Lavar con concentraciones crecientes de agentes competidores para desplazar los antígenos fuertemente unidos, eluyéndolos.

Introducir vesículas bacterianas de la membrana externa, u OMV, con una proteína de captura unida a la superficie e incubar.

Las etiquetas peptídicas de antígeno se unen a las proteínas de captura, formando una vacuna OMV con una pantalla de antígeno multivalente.

Realice la purificación OMV SpyCatcher. Comience centrifugando la solución bacteriana. Filtre el sobrenadante con un filtro de membrana de 0,22 micrómetros, luego concéntrelo usando una columna de fibra hueca. Filtre el concentrado a través de un filtro de membrana de 0,22 micrómetros, luego centrifugue a 150.000 veces g a 4 grados centígrados durante dos horas con una ultracentrífuga y deseche el sobrenadante con una pipeta. Vuelva a suspender la precipitación con PBS y guárdela a menos 80 grados centígrados.

Para realizar la transfección RBD-SpyTag, comience seleccionando un sistema de expresión eucariota apropiado y cultive las células durante la noche a 130 rotaciones por minuto a 37 grados Celsius después de la recuperación. Agregue 20 microlitros HEK293F de solución celular en el contador de células automatizado. Registre el número de celdas. Ajuste la concentración a 1 por 10 a las seis células por mililitro y luego cultive las células a 130 rotaciones por minuto a 37 grados Celsius durante 4 horas.

Filtre el plásmido RBD-SpyTag a través de un filtro de membrana de 0,22 micrómetros y agregue 300 microgramos de plásmidos en el medio de cultivo celular hasta que el volumen final sea de 10 mililitros. Agite durante 10 segundos. Caliente el PEI a 65 grados centígrados en el baño de agua. Mezcle 0,7 mililitros de PEI con 9,3 mililitros de medio de cultivo celular y agite intermitentemente durante 10 segundos.

Agregue una solución plásmida a la solución de PEI. Agite la mezcla de forma intermitente durante 10 segundos e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Agregue la mezcla a 280 mililitros de medio de cultivo celular y cultive a 130 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados durante 5 días.

A continuación, realice la purificación RBD-SpyTag. Comience centrifugando las células a 6.000 veces g a 25 grados centígrados durante 20 minutos. y use una pipeta para recolectar el sobrenadante. Construya la columna con 2 mililitros de agarosa de níquel-NTA y lávela tres veces con PBS.

Agregue imidazol en el sobrenadante celular para hacer la concentración final de 20 milimolares y cargue el sobrenadante celular. Agregue 3 volúmenes de columna de PBS que contengan 20 milimolares de imidazol para lavar y recolecte la fracción de lavado. Eluido en gradiente con tres volúmenes de columna de PBS que contienen concentraciones bajas a altas de imidazol. Eluir dos veces para cada concentración.

Para determinar la concentración de proteína por el método BCA, diluya en serie la solución de proteína BSA estándar de 2 a 0,0625 miligramos por mililitro. Diluya el OMV SpyCatcher purificado y el RBD-SpyTag 10 veces. Luego, mezcle las soluciones de trabajo BCA A y B en una proporción de 50 a 1. Agregue una solución de proteína diluida y mezcle con la solución de trabajo de BCA. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Mida la absorbancia a 562 nanómetros de cada pocillo y calcule la concentración de proteína a partir de la curva estándar.

Para realizar la bioconjugación de OMV SpyCatcher y RBD-SpyTag, mezcle OMV SpyCatcher en RBD-SpyTag en PBS en una proporción de 40 a 1. Gire verticalmente para mezclar la mezcla durante la noche a 15 rotaciones por minuto a 4 grados centígrados. Realice la purificación de OMV RBD utilizando la solución PBS utilizando un procedimiento similar a la purificación OMV SpyCatcher.