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Inmunología
0 vistas • 4:22 min • July 8th, 2025
Tome una mezcla de un ARN CRISPR, o ARNcr, y un ARNcr o ARNcr transactivador.
Calentar la mezcla y dejar que se enfríe, facilitando el emparejamiento de bases del tracrRNA con el crRNA para formar un ARN guía o gRNA.
Agregue tijeras moleculares llamadas enzimas Cas9 que se unen al ARNg, creando complejos.
Agregue los complejos Cas9-gRNA a las células Natural Killer o NK suspendidas en una solución de electroporación.
Introducir moléculas de ADN monocatenario que ayudan a transportar complejos Cas9-gRNA.
Transfiera la mezcla a una cubeta y realice la electroporación, creando poros temporales en la membrana para que los complejos ingresen a la célula.
El ARNg se une al sitio objetivo en el genoma, lo que permite que Cas9 escinda el ADN.
Las proteínas de reparación se unen en el sitio de ruptura y se unen al ADN, lo que a menudo causa errores de inserción o eliminación de pares de bases. La modificación resultante interrumpe el gen diana, haciéndolo no funcional.
Transfiera las células modificadas genéticamente a un medio adecuado para su posterior análisis.
El día de la electroporación, llene un matraz T25 con 8 mililitros de medio de cultivo fresco suplementado con 100 UI por mililitro de IL-2 por condición celular experimental, y coloque los matraces en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius y 5% deCO2.
Mientras el medio se equilibra, agregue de 3 a 4 x 106 celdas por condición, por 26 microlitros de mezcla de transducción en un tubo cónico y granular las celdas por centrifugación. Luego, lave las células tres veces en 12 mililitros de PBS estéril por lavado para eliminar todo el FBS de las suspensiones celulares.
Mientras se lavan las células, vuelva a suspender cada ARN CRISPR y ARN trazador a 200 concentraciones finales micromolares. Mezcle 2,2 microlitros de cada ARN CRISPR con un volumen de 200 micromolares de ARN trazador por muestra y caliente las muestras a 95 grados centígrados durante 5 minutos. Luego, deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente y almacene los complejos CRISPR ARN-ARN trazador a 20 grados Celsius negativos hasta su uso.
Para formar los complejos de ribonucleoproteína, agregue la endonucleasa Cas9 al complejo de ARN CRISPR - ARN trazador correspondiente apropiado con remolinos durante 30 a 60 segundos, e incube los complejos de ribonucleoproteína Cas9 resultantes a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos.
Después del último lavado, agregue todo el volumen de suplemento de electroporación del kit de solución P3 de Nucleofector y vuelva a suspender cada gránulo celular en 20 microlitros de la solución primaria P3 4D-Nucleofector, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire.
Agregue inmediatamente 5 microlitros de cada complejo de ribonucleoproteína a la suspensión celular apropiada y agregue 1 microlitro de potenciador de electroporación Cas9 de 100 micromolares a la mezcla celular del complejo ribonucleoproteico Cas9. Transfiera 26 microlitros de la solución celular de ribonucleoproteína Cas9 a pocillos individuales de una tira de nucleocuvette y golpee suavemente la tira para asegurarse de que las muestras cubran el fondo de cada pocillo.
Luego, inicie el programa EN-138 del sistema 4D-Nucleofector. Al final de la transducción, deje reposar las células durante tres minutos. A continuación, añada 80 microlitros del medio de cultivo preequilibrado a cada cubeta y transfiera suavemente las muestras a un matraz por condición a 37 grados centígrados de incubación.