JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
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Comience con plásmidos bidireccionales que transportan ADNc que codifican ciertas proteínas esenciales virales de una cepa de influenza adaptada al frío.
Introducir un nuevo conjunto de plásmidos bidireccionales que contienen hemaglutinina y ADNc de neuraminidasa modificada de una cepa de influenza diferente.
Introduzca un reactivo de transfección a esta mezcla e incube para formar un complejo con los plásmidos.
Transfiera estos complejos a células similares a epiteliales humanas cultivadas para permitir la entrada de plásmidos en la célula.
Los plásmidos bidireccionales con dos promotores en orientaciones opuestas permiten la producción de proteínas virales y su correspondiente ARN.
Incube las células a una temperatura más baja.
Las proteínas virales y los ARN virales se autoensamblan para formar virus de influenza recombinantes adaptados al frío con replicación reducida en condiciones más cálidas.
Superposición con células MDCK que sobreexpresan ácido siálico y enzimas tripsina modificadas que permiten la unión viral y la entrada dentro de las células.
Incubar a la misma temperatura para inducir la replicación y producción de nuevos virus.
Centrifugar y cosechar los virus vivos atenuados recombinantes listos para una preparación de vacuna.
Para comenzar, coloque un millón de células 293T en cada pocillo de una placa de 6 pocillos con DMEM que contenga un 10% de suero bovino fetal y un 1% de estreptococo de pluma. A continuación, prepare suficiente mezcla de transfección de plásmidos para 100 microlitros por pocillo. Combine un microgramo de cada plásmido y llene el tubo con medio celular Opti-MEM precalentado a 50 microlitros. En otro tubo, agregue el doble del volumen de lipofectamina 2000 correspondiente a la cantidad total de plásmido a transfectar, y complete el tubo a 50 microlitros con Opti-MEM.
Antes de agregar la mezcla de transfección a las celdas, déjela reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue 100 microlitros de la mezcla de transfección a cada pocillo y mueva la placa a una incubadora durante 16 horas. Al día siguiente, cambie el medio a DMEM con 0.3% de BSA y 1% de estreptococo de pluma. Entonces. mueva las celdas a 33 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante cinco horas.
Después de cinco horas, agregue una superposición de un millón de células MDCK permisivas a la influenza en DMEM suplementado con tripsina. Mantener los cocultivos durante 2 a 3 días bajo el régimen de incubación de 33 grados centígrados para generar y amplificar el virus. Más tarde, limpie los escombros con un giro de 260 g de cinco minutos, luego recoja los sobrenadantes.