La detección de modificaciones de las histonas en hojas de las plantas

Un enfoque confiable y útil para detectar modificaciones de las histonas en los genes específicos de la planta se describe. El enfoque combina la cromatina immunoprecipitation (CHIP) y en tiempo real PCR cuantitativa. Que permite la detección de modificaciones de las histonas en los genes específicos con un papel en diversos procesos fisiológicos.

El siguiente método ofrece una detección fiable y sensible de modificaciones específicas de la cromatina en genes de plantas seleccionados. Primeras histonas modificadas de reticulado y ADN con formaldehído. A continuación, extraiga y sonicare la cromatina para facilitar la inmunoprecipitación con anticuerpos específicos de modificación.

Por último, analizar la reacción del chip mediante la unión de escoria de complejos de ADN de histonas y PCR cuantitativa en tiempo real específica de genes. En las plantas, este enfoque puede proporcionar información molecular, como las modificaciones específicas de las histonas asociadas con la fotosíntesis de C four en el laberinto y la inmunidad sistémica en Arabidopsis. La principal ventaja de la inmunoprecipitación de cromatina sobre los métodos existentes como la espectrometría de Marte es que esta técnica permite la detección de modificaciones histonómicas en secuencias seleccionadas en el genoma de la planta.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el protocolo implica un par de pasos cuya correcta realización es clave para el éxito del procedimiento. En este video, utilizamos el análisis de chips para proporcionar información sobre la desregulación de la expresión génica en la planta modelo Arabidopsis ANA, demostrando que el procedimiento será mic. Yakovich, un estudiante de doctorado Para cada muestra comienza con una cosecha de dos gramos de hojas de arabidopsis y un tubo de plástico de 50 mililitros. Llene la marca de 40 mililitros con tampón de reticulación y coloque una esponja de filtro personalizada justo encima de la superficie del tampón para asegurarse de que las hojas permanezcan sumergidas.

Ahora, coloque las muestras en un desecado al vacío y filtre durante 10 minutos. Para detener la reacción de reticulación, agregue 2,5 mililitros de glicina molar y mezcle por inversión. Luego infiltre nuevamente durante cinco minutos, continúe aspirando, infílclese durante otros cinco minutos.

Luego deseche el líquido mientras cosecha las hojas en un colador. Después de lavar las hojas dos veces con un litro de agua en un vaso de plástico, seque bien las hojas con toallas de papel, recoja las hojas en un tubo de plástico fresco y congélelas en nitrógeno líquido. Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta el aislamiento de la cromatina.

Con un mortero enfriado con nitrógeno líquido, muela las muestras congeladas hasta obtener un polvo fino. Transfiere el polvo a un tubo de plástico de 50 mililitros. Suspenda el polvo en 30 mililitros de tampón de extracción número uno e incube durante 15 minutos a cuatro grados centígrados en un agitador superior.

Pase la suspensión a través de cuatro capas de tela de espejo a un tubo de plástico nuevo de 50 mililitros. Después de la centrifugación, deseche la SUP natina. A continuación, utilice un pincel para resuspender el pellet en 50 microlitros de tampón de extracción número dos, luego agregue otros 950 microlitros de tampón de extracción.

Número dos, transfiera la suspensión a un tubo de micro fuga de 1,5 mililitros y centrifugue durante 10 minutos. Mientras tanto, prepare dos tubos de micro fuga de mililitros que contengan 1,5 mililitros de tampón de extracción. Número tres.

A continuación, deseche los sobrenadantes para suspender gradualmente el pellet en 300 microlitros de tampón de extracción. Número tres. Primero, agregue un pequeño volumen de búfer.

Número tres, suspenda el pellet con un pincel y luego agregue el tampón restante. Ahora coloque cuidadosamente las muestras sobre los tubos preparados de 1,5 mililitros de tampón de extracción. Número tres, garantizar que las dos fases no mezclen muestras de centrífuga durante una hora a 16.000 veces G a cuatro grados centígrados.

Deseche la sup natin y suspenda la bolita de cromatina con un pincel en 300 microlitros de cromatina tampón de sonicación hasta un tamaño de ADN de aproximadamente 400 pares de bases. Cuando esté sonicate, asegúrese de que la cromatina no se caliente por encima de aproximadamente 30 grados centígrados. Para proteger los enlaces cruzados sensibles al calor, centrifugar la muestra de sonicateto para precipitar el material no resuelto y cosechar el sobrenadante en tubos de microfuga de dos mililitros que contienen proteína agarosa y tampón de unión a anticuerpos.

Añadir 200 microlitros de la preparación de cromatina de la muestra. Incubar los tubos durante una hora en un agitador de techo. Después de la centrifugación, recoja los sobrenadantes de la muestra y alícuota 30 microlitros de proteína.

Tubos de 1,5 mililitros para la determinación de la concentración de cromatina del material de entrada. Reserva 40 microlitros de la cromatina sonicada. A continuación, añada 400 microlitros de la suspensión de cromatina sonicada a los 30 microlitros de proteína aros y una cantidad adecuada de anticuerpo específico de modificación incubará durante la noche en un agitador superior a cuatro grados centígrados.

Cosechar las perlas durante dos minutos a 440 veces G. Retirar el sobrenadante y realizar lavados sucesivos de 10 minutos de los gránulos de perlas con 900 microlitros del tampón respectivo en un agitador aéreo. Después del lavado final, elimine por completo cualquier tampón restante. Para liberar el ADN de las histonas, agregue 400 microlitros de tampón de reticulación D a las perlas y la muestra de entrada de 40 microlitros conservada durante muestras de centrífuga de cinco minutos, e incube a 65 grados Celsius durante la noche.

Ahora, purifique el ADN con un kit comercial de purificación de ADN y realice un R-T-P-C-R cuantitativo en tiempo real específico del locus convencional. En este ejemplo, la expresión del gen de defensa ANA PR de Arabidopsis fue inducida por Benzo Díaz ole, un análogo sintético de la hormona vegetal, el ácido salicílico. Los resultados demuestran que la activación de la expresión de PR dos se asocia con un aumento en la acetilación de los residuos de lisina en las histonas H tres y H cuatro en el promotor de PR dos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la adición de tampón de extracción uno al polvo de hojas causa una sobrepresión en el tubo fcon cerrado. Recuerde abrir el tubo de vez en cuando. Además, recuerde no quitar el pincel después de la suspensión de los gránulos antes de agregar el siguiente tampón.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo determinar sus modificaciones y palancas simples donde se forma la reticulación de ADN e histonas basada en aldehídos, el aislamiento de la inmunoprecipitación de cromatina y la cuantificación de ADN locus específico para responder preguntas clave sobre el papel de la cromatina y sus modificaciones en diferentes campos de la biología vegetal.