JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
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Tome una placa de pocillos múltiples que contenga células asesinas naturales o NK y células cancerosas. Los pozos de control contienen solo células cancerosas.
Centrífuga para facilitar el contacto celular.
incubar. Los receptores activadores en las células NK se unen a los ligandos de la superficie de las células cancerosas, lo que hace que las células NK liberen gránulos que contienen moléculas citotóxicas.
Estas moléculas crean poros de la membrana de las células cancerosas e inducen la apoptosis liberando contenidos intracelulares, incluida la lactato deshidrogenasa o LDH.
Agregue un detergente para lisar las células cancerosas en los pocillos de control para obtener la máxima liberación de LDH.
Centrifugar y transferir una porción de sobrenadantes que contienen LDH a una placa de ensayo.
Agregue el reactivo de ensayo e incube.
La LDH convierte el lactato en piruvato reduciendo el NAD+. La diaforasa utiliza NADH para reducir la sal de tetrazolio, formando un producto formazán de color rojo.
Agregue una solución ácida para detener la reacción enzimática.
Utilice un lector de microplacas para medir la absorbancia de formazán en los pocillos.
La intensidad del formazán es proporcional al número de células cancerosas lisadas en el pocillo de prueba, lo que indica citotoxicidad de las células NK contra las células cancerosas.
Primero, obtenga una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de fondo redondo y configúrela como se describe en la tabla 1 del protocolo de texto. Centrifugar la placa de ensayo a 250 veces g durante 4 minutos para asegurarse de que el efector y las células diana están en contacto. A continuación, incube la placa en una cámara humidificada a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 5 horas.
45 minutos antes de cosechar los sobrenadantes, agregue 10 microlitros de solución de lisis 10x a los pocillos de liberación máxima de LDH de la célula diana y devuelva la placa a la cámara humidificada. Cuando se complete la incubación, centrifugar la placa a 250 veces g durante 4 minutos. Luego, use una pipeta multicanal para transferir alícuotas de 50 microlitros de cada pocillo a una placa de ensayo de fondo plano de 96 pocillos nueva.
Agregue 50 microlitros de reactivo de ensayo a cada pocillo de la placa de ensayo. Cubra el plato con papel de aluminio para protegerlo de la luz e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de esto, agregue 50 microlitros de solución de parada a cada pocillo. Asegúrese de leer la placa dentro de 1 hora de agregar la solución de parada y registre la absorbancia a 490 nanómetros.