Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:32 min. • July 8th, 2025
Tome una placa de micropocillos recubierta con fragmentos de fibronectina recombinante y agregue células T murino CD8 positivas activadas.
Introducir vectores retrovirales que contengan un ARN transgénico que codifique un receptor de antígeno quimérico o CAR.
Cubra el plato y séllelo en una bolsa para evitar la contaminación. Centrifugar la placa a baja velocidad para facilitar la interacción virus-célula.
La fibronectina se une al virus y a la célula, colocalizándolos para mejorar la transferencia de genes mediada por virus.
Después de la centrifugación, retire la bolsa sellada e incube la placa en condiciones fisiológicas.
La envoltura del vector viral se fusiona con la membrana celular, liberando el ARN viral y las enzimas.
Las enzimas virales transcriben inversamente el ARN liberado e integran el ADN resultante en el genoma del huésped, lo que permite a las células expresar CAR unidos a la superficie.
El CAR comprende un dominio de unión al antígeno específico del antígeno diana y dominios de señalización para la activación de las células T.
Las células T con CAR específicas de antígeno están listas para ensayos posteriores.
El día 1, prepare placas recubiertas de fragmentos de fibronectina humana agregando 0,5 mililitros de fibronectina a los pocillos de una placa de 24 pocillos e incubándola durante la noche a 4 grados centígrados.
Al día siguiente, retire la solución de fibronectina y agregue 1 mililitro de BSA al 2% en PBS por pocillo. Incube la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos y lave los pocillos tratados con 1 mililitro de PBS estéril. La placa está lista para usar después de retirar la solución de lavado.
Cuente las células T CD8 activadas usando azul de tripano. Recójalos por centrifugación y vuelva a suspenderlos a 5 millones de células viables por mililitro para su transducción. Agregue 100 microlitros de la suspensión de células CD8 activadas a cada pocillo de la placa recubierta de fibronectina. Luego, agregue de 1,5 a 2 mililitros del medio que contiene virus previamente preparado y mezcle con un movimiento giratorio para dispensar uniformemente las células.
Selle la placa en una bolsa con cierre hermético y centríquela a 2000 veces g durante 90 minutos a 37 grados centígrados. Retire la placa de la centrífuga y llévela a un gabinete de seguridad biológica. Retire con cuidado la bolsa de plástico y asegúrese de que el exterior de la placa no esté contaminado con medio. Transfiera la placa a una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados Celsius.
Después de 4 horas, retire 1 mililitro de medio de cada pocillo. Reemplácelo con 1 mililitro de medio de células T completo precalentado y vuelva a colocar la placa en la incubadora.