Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 2:43 min. • July 8th, 2025
Comience con una solución de polímero congelado que contenga polímeros cargados positivamente.
Descongele la solución de polímero hasta que alcance la temperatura ambiente.
Agregue un tampón y un vórtice para una mezcla uniforme, generando una solución homogénea.
Introduzca el ARNm objetivo en la solución polimérica en una proporción igual para una reacción óptima.
Incubar para permitir que los polímeros cargados positivamente interactúen con los grupos fosfato cargados negativamente en el ARNm a través de interacciones electrostáticas.
Esto facilita la incorporación del ARNm dentro de la estructura del polímero, formando nanopartículas de complejos ARNm-polímero o poliplexes.
Transfiera estos poliplex a un tubo que contenga agua libre de ARNasa.
Mézclalos y deja la precipitación de los poliplexes.
Introducir un tampón que contenga sacarosa y congelarlo. La sacarosa actúa como un crioprotector que mantiene la integridad estructural de los poliplexos.
Luego, realice la liofilización para eliminar cualquier rastro de agua.
Guárdelo a baja temperatura como candidato a vacuna de ARNm para uso futuro.
Para la formación de poliplex, descongele los polímeros C-6 péptidos poli-beta amino ésteres previamente preparados y agite la solución. Después de pipetear la mezcla de polímeros hacia arriba y hacia abajo, prepare una solución de 12,5 milimolares en acetato de sodio. Agite la solución y espere 10 minutos.
A continuación, prepare el ARNm a 0,5 miligramos por mililitro y mezcle mediante pipeteo. Vuelva a agitar la solución de polímero. Luego, mezcle la solución de material genético en la solución de polímero en una proporción de uno a uno en un tubo de microcentrífuga e incube el tubo a 25 grados Celsius durante 30 minutos en un bloque térmico. Después de la incubación, precipite la mezcla con una o dos aguas libres de ARNasa agregando la muestra a un tubo de microcentrífuga que contenga el agua.
Luego, para incluir los excipientes, agregue HEPES de 20 milimolares y solución de sacarosa al 4 por ciento en el mismo volumen que la mezcla de ARNm y ésteres amino poli-beta y mezcle mediante pipeteo. Para la liofilización, después de congelar la solución de poliplex a menos 80 grados Celsius durante una hora, realice el secado primario y luego almacene inmediatamente los poliplexes a menos 20 grados Celsius para evitar la rehidratación.