Construcción de un modelo de ratón humanizado con inmunidad modificada contra el VIH

Prepare un ratón receptor gravemente inmunocomprometido anestesiado.

Haga una incisión para exponer el riñón y crear un orificio en la cápsula renal.

Tome una aguja de implante que contiene tejido del timo fetal humano y células derivadas del hígado fetal suspendidas en una mezcla de proteínas gelatinosas.

Las células incluyen células madre hematopoyéticas modificadas, o HSC, que expresan receptores de antígenos quiméricos, o CAR, dirigidos contra el VIH.

Implante la suspensión celular y el tejido del timo debajo de la cápsula, luego cierre la incisión.

A continuación, inyecte retroorbitalmente las HSC que expresan CAR y permita que el mouse se recupere.

En el riñón, la mezcla de proteínas gelatinosas se polimeriza en una matriz, reteniendo las HSC en el sitio de implantación.

Las HSC de la matriz migran al timo, diferenciándose en células T humanas funcionales.

Mientras tanto, las HSC inyectadas retroorbitariamente llegan a la médula ósea y se diferencian en células B humanas funcionales, monocitos y células NK.

El modelo de ratón con un sistema inmunológico humano contra el VIH ya está listo.

Vierta los trozos de timo y el medio del matraz en un plato de 60 milímetros. Enfríe algunas puntas de pipeta de desplazamiento positivo colocándolas en tubos abiertos estériles con tapón de rosca de 1,5 mililitros sobre hielo. Además, coloque los gránulos celulares y un volumen de mezcla de proteínas gelatinosas, como Matrigel, en hielo.

Anestesiar a los ratones receptores con un anestésico inyectable de acuerdo con un protocolo animal aprobado. Verifique el nivel de anestesia del ratón apretando una pata. La ausencia de una reacción al pellizco indica un plano quirúrgico de anestesia.

Afeite el lado izquierdo de cada ratón desde la cadera hasta el hombro, entre el centro de la espalda y el estómago. Por vía subcutánea, inyecte 6 miligramos por kilogramo de carprofeno diluido en el hombro o triángulo inguinal del animal. Enjuague la cánula del trocar con PBS en un plato de 60 milímetros. Con un par de pinzas curvas y romas, coloque un trozo de timo del plato de 60 milímetros justo dentro de la abertura de la cánula, luego tire hacia atrás del trócar para aspirar el tejido hacia la cánula.

A continuación, utilice una pipeta de desplazamiento positivo y una punta fría para añadir 5 microlitros de mezcla de proteínas gelatinosas frías en el tubo con el gránulo celular, y revuelva suavemente para generar la suspensión celular. Pipetea la suspensión celular en la abertura de la cánula y tira lentamente del trócar para cargar la aguja.

Frote el área afeitada del ratón con povidona yodada seguida de isopropanol tres veces. Determine la mancha más oscura debajo de la piel, que indica la ubicación del bazo. El riñón mide aproximadamente 5 milímetros dorsales del bazo.

Después de asegurar un nivel adecuado de anestesia por la ausencia de una reacción al pellizco de la pata, use fórceps curvos para levantar la piel y use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de 15 milímetros en la piel paralela al bazo. Luego, haga un corte similar en la capa de peritoneo debajo.

En los hombres, el riñón es fácilmente visible, por lo que se extruye simplemente presionando el abdomen. Sostenga el riñón con un hemostático o un par de fórceps curvos romos. En las mujeres, los ovarios tienden a bloquear el riñón para que no sea fácil de extraer. Con un hemostático, levante el ovario y exponga cuidadosamente el riñón.

Use fórceps con punta de aguja para extraer un pequeño orificio en el extremo posterior de la cápsula renal. Deslice el trócar en este orificio y a lo largo del riñón hasta que la abertura de la cánula esté completamente cubierta por la cápsula renal. Extruya suavemente el tejido debajo de la cápsula renal y tire del trócar hacia afuera. Use unas pinzas curvas para asegurarse de que la pieza del timo no se salga con la aguja.

Luego, levante el peritoneo con las pinzas y use suavemente el hemostático para empujar el riñón a su lugar. Ate una puntada de doble nudo con sutura quirúrgica en el peritoneo. Además, coloque dos clips automáticos para cerrar la piel.

Ahora, mezcle las células CD34 positivas transducidas y aspire 0,5 x 10⁶ células en un volumen de 100 microlitros en una jeringa de insulina. Inyecte estas células en el ratón mediante una inyección en la vena retroorbitaria.

Después de la inyección, frote una pequeña gota de lubricante para los ojos en cada ojo y coloque al ratón de lado en una jaula. Después de implantar todos los ratones, confirme que los animales han recuperado la conciencia y son ambulatorios antes de devolverlos a la sala de alojamiento.