Administración oral de células de levadura transformadas en el sistema inmunitario intestinal del ratón

Comience con un tubo oral que contenga una suspensión de levadura auxotrófica transformada genéticamente que no puede producir nucleobase de uracilo.

Inserte el tubo oral en la boca de un ratón restringido y guíelo hacia el estómago.

Administre la suspensión de levadura directamente en el estómago, permitiendo que eventualmente llegue al intestino delgado.

El intestino delgado contiene células epiteliales, con parches subyacentes de Peyer ricos en células inmunitarias.

Las células microplegadas, células epiteliales intestinales especializadas cerca de los parches de Peyer, engullen las células de levadura y las internalizan en vesículas.

Estas vesículas se mueven a través de las células y liberan células de levadura en el parche de Peyer subyacente.

Aísle el parche de Peyer del intestino de ratón sacrificado y obtenga una suspensión celular uniforme.

Cultive esta suspensión celular en un medio selectivo de levadura que contenga uracilo.

La levadura auxotrófica utiliza el uracilo y se multiplica para formar colonias, lo que confirma la entrega de células de levadura transformadas al sistema inmunológico intestinal del ratón.

Después de preparar cultivos de levadura de acuerdo con el protocolo de texto, use un hemocitómetro para determinar la concentración celular y ajústelo a 10 a la novena célula por mililitro. Peletizar las células por centrifugación a 2.500 veces g durante tres minutos. Luego, vierta el sobrenadante y vuelva a suspender las células agregando el volumen apropiado de agua estéril y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.

Fije una aguja de sonda de calibre apropiado en una jeringa estéril de 1 mililitro y cargue la muestra de levadura, eliminando cualquier burbuja de aire. Cargue una jeringa adicional con agua estéril para los ratones de control de sondas. Con la mano no dominante, levante el mouse para amordazarlo y, con el dedo índice y el pulgar, agarre con fuerza la piel alrededor del cuello. Mete la cola debajo del dedo meñique. Asegúrese de que el agarre sea seguro y prohíba que el mouse mueva la cabeza.

Luego, inserte suavemente la aguja de sonda en el esófago del ratón inclinando la aguja a lo largo del paladar y la parte posterior de la garganta, manteniéndose ligeramente a la izquierda del centro. Espere a que el ratón se trague el bulbo de la aguja. Si siente resistencia o el ratón jadea, retire suavemente la aguja y vuelva a intentar encontrar el esófago.

Después de que el ratón se haya tragado el bulbo de la aguja amordazada, presione suavemente el émbolo de la jeringa para administrar la levadura directamente en el estómago del ratón. Retire suavemente la aguja de sonda del estómago y el esófago del ratón y devuelva el ratón a la jaula. Verifique que el mouse respire y se mueva normalmente para asegurarse de que la sonda se haya realizado correctamente.

Después de sacrificar el ratón de acuerdo con el protocolo de texto, colóquelo con el abdomen completamente expuesto y use etanol al 70% para rociar el área abdominal. Con unas tijeras, haga una incisión transversal a través del pelaje y la piel. Luego, haga palanca manualmente para abrir la incisión para exponer aún más el peritoneo, el delgado revestimiento de serosa que cubre los órganos abdominales. Levante suavemente el peritoneo y haga una incisión transversal para exponer los intestinos.

Luego, use fórceps romos para separar con cuidado el intestino delgado de las arterias mesentéricas, la grasa y otros tejidos. Exponga el intestino delgado desde el estómago en el cuadrante superior izquierdo del abdomen del ratón hasta el ciego, la gran bolsa de tejido intestinal al comienzo del intestino grueso.

Luego, aísle los parches de Peyer buscando parches de tejido opaco de 1 a 2 milímetros aproximadamente circulares a lo largo del intestino delgado. Luego, con unas tijeras de disección curvas, corte la cúpula del parche de Peyer, dejando márgenes para asegurarse de que no se recoja nada del tejido circundante.

Transfiera los parches de Peyer disecados a IMDM completo. Luego, vierta la solución con parches de Peyer suspendidos en un colador celular de 40 micrómetros. Después de lavar los parches de Peyer con IMDM completo, use un émbolo de una jeringa de 1 mililitro para romper suavemente el tejido y recolectar las células en un tubo de 50 mililitros. Granular las células coladas a 1,800 RPM durante siete minutos. Luego espere y analice las celdas de acuerdo con el protocolo de texto.