Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 4:21 min. • July 8th, 2025
Tomemos un tumor de melanoma murino que comprende neutrófilos asociados al tumor o TAN.
Los TAN muestran una actividad elevada de la enzima nicotinamida fosforribosiltransferasa, o NAMPT, estimulando la angiogénesis, la proliferación de vasos sanguíneos en los tumores y facilitando el crecimiento tumoral.
Pica el tejido y agrega enzimas para degradar la matriz del tejido, aflojando las células.
Filtrar la suspensión a través de un colador y centrifugar para granular las células.
Agregue un tampón de lisis para lisar los glóbulos rojos, luego centrifugue y deseche el sobrenadante que contiene restos celulares.
Introducir anticuerpos para bloquear los receptores Fc celulares, evitando así la inmunotinción inespecífica.
Introduzca un cóctel de anticuerpos marcado con fluoróforo específico para marcadores de superficie en TAN y un tinte para discriminar las células muertas.
Usando FACS, aísle los TAN viables marcados con fluoróforo y transfiéralos a una microplaca.
Agregue un inhibidor que bloquee la actividad de NAMPT a los pocillos seleccionados e incube.
Utilice las células para evaluar su capacidad estimulante de la angiogénesis. Los TAN tratados con inhibidores muestran una angiogénesis reducida en comparación con los TAN no tratados.
Para el aislamiento de neutrófilos asociados a tumores, coloque cinco tumores por pocillo en pocillos individuales de una placa estéril de seis pocillos, a medida que se recolectan, y use tijeras estériles para picar los tumores en trozos de 2 a 3 milímetros. A continuación, digiera los fragmentos tumorales con 1 mililitro de solución de colagenasa I basada en disco durante 45 minutos a 37 grados Celsius y dióxido de carbono al 5% con humedad, mezclando las muestras con una jeringa de 10 mililitros cada 15 minutos.
Al final de la incubación, filtre las células a través de filtros de 100 micrómetros en un tubo de 15 mililitros por pocillo para eliminar las fibras no digeridas, y agregue PBS hasta un volumen final de 15 mililitros. Recoger las células disociadas por centrifugación y lisar los glóbulos rojos con 1 mililitro de tampón de lisis por tubo.
Después de mezclar, combine el contenido de cada tubo en un solo tubo de 15 mililitros, deteniendo la reacción después de dos minutos con 11 mililitros de medio completo de 4 grados Celsius. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de PBBS y bloquee cualquier unión inespecífica con tres microlitros de anticuerpo bloqueado por FC durante 15 minutos en hielo.
Al final de la incubación, etiquete las células con anticuerpos anti-CD11b y Ly6G y cualquier otro anticuerpo de interés más DAPI para una incubación de 30 minutos en hielo protegido de la luz. Al final de la incubación, lave las células en 14 mililitros de PBS y vuelva a suspender los gránulos a 1 x 107 células por mililitro de concentración de medio fresco completo en hielo.
A continuación, clasifique los neutrófilos positivos para CD11b con alto contenido de DAPI en un clasificador de células activado por fluorescencia de acuerdo con los protocolos de clasificación estándar, comprobando la pureza de los neutrófilos aislados en el citómetro de flujo al final de la clasificación. Para la inhibición de neutrófilos asociada a tumores in vitro, siembre 1,5 veces 10 a los quintos neutrófilos clasificados en cada uno de los dos pocillos de una placa de fondo en U de 96 pocillos, y agregue FK866 a una concentración final de 100 nanomolares en medio completo en un pocillo y un volumen igual de medio completo solo en el otro pocillo. Después de dos horas en la incubadora de cultivo celular, lave las células dos veces con PBS y vuelva a suspender los gránulos en PBS a la concentración adecuada para la inyección posterior.