Una técnica de conjugación avidina-biotina para presentar antígenos diana en Mycobacterium bovis BCG

Comience con una suspensión de Mycobacterium bovis BCG, tratada con un tensioactivo no iónico, para evitar la aglomeración bacteriana.

A continuación, agregue un reactivo de biotinilación e incube.

Este reactivo de biotinilación, un complejo de biotina complejado a un enlazador funcional, facilita la unión de moléculas de biotina a las proteínas de la superficie bacteriana, marcando bacterias.

Después de la incubación, centrifugar la suspensión bacteriana marcada con biotina para eliminar el reactivo de biotinilación sin reaccionar.

Vuelva a suspender las bacterias en un tampón. Agregue una solución de proteína de fusión de avidina, una proteína recombinante que comprende un dominio de antígeno diana fusionado con avidina monomérica.

Durante la incubación, la avidina se une a la biotina, facilitando la modificación de la superficie bacteriana con antígenos diana.

Centrifugar la suspensión para eliminar las proteínas de fusión no unidas.

Vuelva a suspender las bacterias recubiertas de antígeno en un tampón que contenga un tensioactivo no iónico. El recubrimiento de antígeno de las bacterias puede mejorar su propiedad para desencadenar respuestas inmunes.

Trabaje en un gabinete de bioseguridad utilizando equipo de protección personal porque BCG es un patógeno de nivel II.

Para biotinilar la superficie de las células BCG, primero, haga crecer las células en una plataforma agitadora a la densidad adecuada. Recoja alrededor de mil millones de células y lávelas tres veces con 500 microlitros de PBST helado sin endotoxinas. Luego, gire las células hacia abajo y suspélvalas en PBS estéril libre de endotoxinas. A continuación, prepare biotina fresca de 10 milimolares Sulfo-NHS SS en agua filtrada estéril. Luego, incube bacterias en 1 mililitro de caldo que contenga 0,5 milimolares de biotina Sulfo-NHS SS. Realice la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos.

A continuación, lave las bacterias ahora etiquetadas tres veces con 500 microlitros de PBST helado, para eliminar el reactivo sin reaccionar. Luego, vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de PBST.

Mezcle 500 millones de BCG biotinilados con proteína de fusión de avidina, para obtener una concentración final de 10 microgramos de proteína por mililitro. Deje que esta reacción continúe durante una hora a temperatura ambiente en una coctelera. A continuación, lave las bacterias tres veces con 500 microlitros de PBST helado.