Una técnica para cultivar neuronas del hipocampo de ratón

Tome un hipocampo de cachorro de ratón cosechado en un amortiguador.

Corta el hipocampo en fragmentos más pequeños y transfiérelos a un tubo cónico.

Lave el pañuelo con tampón. Una vez que los fragmentos se asienten, retire el búfer. Ahora, agregue tampón fresco y tripsina.

Durante la incubación, la tripsina, una enzima proteolítica, digiere la matriz extracelular del tejido, aflojando las neuronas del hipocampo.

Lave el tejido digerido con tampón.

Una vez que los fragmentos se asienten, retire el búfer. Agregue tampón nuevo y pipetee el tejido repetidamente para disociarlo mecánicamente, obteniendo una suspensión unicelular.

Una vez que el tejido no digerido se asiente, transfiera la suspensión celular a cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina con soportes de cera dentro de una placa de cultivo que contenga medios.

Las células se adhieren a las superficies recubiertas de poli-L-lisina a través de interacciones electrostáticas.

Ahora, coloque los cubreobjetos adheridos a las neuronas boca abajo en un plato que contenga células gliales corticales o no neuronales en un medio libre de suero.

En cultivo, los soportes de cera evitan el contacto directo entre las neuronas y las células gliales, creando un microambiente donde los factores secretados por las células gliales promueven la supervivencia y maduración neuronal.

Para comenzar, diseccione de seis a ocho hipocampos de cachorros posnatales de un día con medio HBSS en una placa de Petri. Pica el hipocampo con unas tijeras de disección en trozos más pequeños y transfiérelos del plato a un tubo de 15 mililitros. Lave los hipocampos dos veces con 5 mililitros de HBSS y déjelos en 4,5 mililitros de HBSS después del lavado.

Agregue 0,5 mililitros de tripsina al 2,5% en 4,5 mililitros de HBSS e incube en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 15 minutos, invirtiendo el tubo cada 5 minutos. Los hipocampos bien digeridos deben volverse pegajosos y formar un racimo. Si es necesario, extienda la digestión por 5 minutos más.

Lave los hipocampos con HBSS tres veces durante 5 minutos por lavado. Después del lavado, agregue 2 mililitros de HBSS y pipetee el hipocampo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta Pasteur 15 veces. Triture el tejido con una pipeta Pasteur pulida al fuego 10 veces y deje reposar el tubo durante cinco minutos hasta que todos los trozos se asienten en el fondo. Repita la trituración con los trozos restantes hasta que la mayoría de ellos hayan desaparecido.

A continuación, utilice una punta de pipeta de 1 mililitro para transferir suavemente el sobrenadante que contiene las neuronas disociadas a los platos de emplatado. Agréguelo directamente al medio de recubrimiento preincubado y agite el plato suavemente. De 2 a 4 horas después de la siembra, revise las placas de siembra con un microscopio óptico. La mayoría de las neuronas deberían haberse adherido al cubreobjetos.

Con unas pinzas de punta fina, voltee los cubreobjetos a las placas de alimentación de células gliales que contienen medio de cultivo neuronal preacondicionado con el lado del punto de cera hacia abajo. Las neuronas pueden crecer en las placas alimentadoras de células gliales hasta por un mes. Alimente las neuronas cada siete días con 1 mililitro de medio de cultivo neuronal fresco.