Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:24 min. • July 8th, 2025
Comience con un criovial que contenga neuronas embrionarias criopreservadas y colóquelo en un bloque calefactor para una descongelación controlada.
A continuación, transfiera las neuronas descongeladas a un tubo y dilúyalas con un medio neurobasal gota a gota para equilibrar la presión osmótica y prevenir la lisis celular.
Esto genera una suspensión homogénea con neuronas uniformemente dispersas.
Siembre la suspensión neural diluida en una placa de pocillos múltiples recubierta de poli-L-lisina que contenga un medio neurobasal enriquecido con nutrientes y antibióticos.
Incubar para permitir que la poli-L-lisina cargada positivamente interactúe con las neuronas a través de interacciones electrostáticas, facilitando su adherencia.
Suministre a los pocillos medios neurobasales frescos.
Incube las células en el mismo medio en condiciones húmedas para evitar la evaporación del medio.
Las neuronas embrionarias utilizan los nutrientes y crecen desarrollando procesos neuronales y formando neuronas primarias.
El medio neurobasal mantiene las neuronas primarias que aparecen muy espaciadas, generando un cultivo primario de baja densidad con conexiones neuronales.
Comience recubriendo una microplaca de 96 pocillos con 100 microlitros de poli-L-lisina por pocillo. A continuación, incube las placas durante la noche a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, retire la solución de poli-L-lisina. Lave las placas dos veces con agua esterilizada y una vez con medio de cultivo fresco sin suplementos. Coloque los platos para que se sequen. Los platos secos se pueden envolver y almacenar hasta por un mes a 4 grados centígrados.
Para comenzar la siembra celular, agregue 50 microlitros del medio de cultivo a cada pocillo en la placa recubierta. Llene los pocillos periféricos con 200 microlitros de agua esterilizada e incube la placa durante una hora a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%.
Retire la neurona criovial del tanque de nitrógeno líquido y colóquela en un bloque de calor a 37 grados centígrados para descongelar parcialmente su contenido. Con una pipeta de 1 mililitro con punta de gran diámetro, transfiera lentamente el contenido del vial gota a gota a un tubo estéril de 50 mililitros. Enjuague el criovial vacío con 1 mililitro de medio de cultivo a temperatura ambiente. Transfiera la solución de enjuague al tubo de 50 mililitros que contiene la suspensión celular.
A continuación, agregue 9 mililitros del medio de cultivo a temperatura ambiente gota a gota en el tubo de 50 mililitros, aumentando el volumen a 11 mililitros. Después de contar las células con un hemocitómetro, transfiera la suspensión celular a un depósito. Ahora, utilizando una pipeta multicanal con puntas de gran diámetro, dispense la suspensión celular con un recuento final de 1,0 x 104 células por pocillo en la placa recubierta de 96 pocillos.
Incube las neuronas durante 1 a 2 horas a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono. Luego reemplace el medio de cultivo con 100 microlitros de medio de cultivo precalentado e incube nuevamente en las mismas condiciones.