Cultivo de neuronas excitadoras fluorescentes a partir del cerebro de un cachorro de ratón transgénico

Tomemos un cerebro de cachorro de ratón transgénico.

Extirpe el cerebelo y diseccione el cerebro. Separar el tejido cortico-hipocampal que contiene neuronas excitadoras que expresan proteínas fluorescentes.

Transfiera el tejido a una placa de cultivo que contenga tampón.

Pica el tejido y transfiérelo a un tubo que contenga papaína.

La papaína digiere la matriz extracelular del tejido, aflojando las células, incluidas las neuronas.

Transfiera el tejido digerido a un tubo con proteínas BSA, deteniendo la actividad enzimática y previniendo el daño celular.

Disociar mecánicamente los tejidos, liberando células.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante que contiene desechos y enzimas.

Vuelva a suspender las células en medios neuronales de baja fluorescencia y filtre a través de un filtro celular, eliminando los agregados celulares.

Realice la clasificación de células activadas por fluorescencia para identificar y clasificar las neuronas fluorescentes.

Transfiera las neuronas clasificadas a un tubo de microcentrífuga y centrífuga. Resuspender neuronas en medios neuronales.

Sembrar neuronas en cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina en una placa de pocillos múltiples. Las neuronas se adhieren a las superficies recubiertas.

Agrega medios neuronales. Incubar para facilitar el crecimiento neuronal.

Primero, disecciona el cerebelo y separa los dos hemisferios. Luego, separe cuidadosamente el hipocampo y la corteza de cada hemisferio. Transfiera el tejido diseccionado a una placa de Petri de 35 milímetros que contenga tampón de cultivo celular refrigerado.

Luego, transfiera el hipocampo y la corteza disecados a la tapa de otra placa de Petri de 35 milímetros. Con el borde plano de una hoja de bisturí, corte con cuidado el tejido con un movimiento entrecruzado hasta que solo queden trozos pequeños.

A continuación, transfiera el tejido picado con una pequeña cantidad de solución de papaína de la tapa de la placa de Petri al tubo de papaína estéril. Incube el tejido a 37 grados centígrados durante 25 minutos. Después de la incubación de papaína, transfiera el tubo de papaína estéril y los tubos BSA estériles a la cabina de flujo. Luego, use una pipeta Pasteur de 1 mililitro para transferir solo el tejido cortico-hipocampal del tubo de papaína al tubo BSA 1.

Para romper cualquier grumo grande de tejido, triture el tejido varias veces con una pipeta Pasteur de 1 mililitro. A continuación, triture el tejido siete veces con una pipeta Pasteur de punta fina. Después de 30 segundos, transfiera 1 mililitro de la solución inferior y el tejido del tubo BSA 1 al tubo BSA 2.

Triture el tejido en el tubo BSA 2 varias veces con una pipeta Pasteur de punta fina. Después de la trituración, transfiera 1 mililitro del tejido inferior en solución del tubo BSA 1 al tubo BSA 3. Triture el tejido en el tubo BSA 3 varias veces.

Después de la trituración, transfiera toda la solución y el tejido de los tubos 2 y 3 al tubo BSA 1. Triturar de 2 a 3 veces más y centrifugar a 3.000 veces g durante 3 minutos. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante del tejido granulado y vuelva a suspender las células con una pipeta P1000 en 2 mililitros de medio completo de baja fluorescencia Hibernate A. Luego, triture el tejido 20 veces para asegurar la resuspensión completa de la solución de tejido.

Posteriormente, filtre la suspensión celular a través de un tamiz celular de 30 micrómetros en un tubo de muestra de poliestireno. Prepare los tubos de recolección de clasificación de células pipeteando 300 microlitros de medios completos de hibernación A al número requerido de tubos de polipropileno.

Para cada tipo de célula fluorescente que se va a clasificar, elija los filtros de excitación y emisión adecuados. Excite la proteína venosa utilizando una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y detecte la luz emitida a través del conjunto de filtros de emisión 530 sobre 40.

Excite la proteína TdTomato utilizando una longitud de onda de excitación de 531 nanómetros y detecte la luz emitida a través de un conjunto de filtros de emisión de 575 sobre 30. Para una alta pureza, clasifique las celdas fluorescentes etiquetadas con colores brillantes. Después de la clasificación de las células, transfiera las células recolectadas a tubos centrífugos de fondo redondo de 2 mililitros. Luego, centrifuga las células a 3.000 veces g durante 3 minutos para formar un gránulo celular.

Vuelva a suspender el sedimento celular en la cantidad requerida de medio NBA completo precalentado para lograr una densidad celular de 1,000 células por microlitro. Para confirmar la presencia de células disociadas, verifique la solución celular bajo un microscopio con una lente de objetivo de 4x o 10x. Antes de enchapar las celdas, haga un vórtice a velocidad media durante 2 a 3 segundos para asegurar una suspensión celular uniforme.

Después del vórtice, pipetee rápidamente 10 microlitros de la suspensión celular en el centro de cada cubreobjetos. Después de una hora, alimente las células con 500 microlitros de medio NBA completo precalentado y regrese a la incubadora a 37 grados centígrados.