Generación de progenitores neurales a partir de células madre embrionarias en cultivos monocapa sin suero

Comience con un cultivo de células madre embrionarias de ratón.

Lave las células con un tampón para eliminar los medios y los restos celulares.

Agregue un cóctel de enzimas para separar las células de la superficie del matraz.

Agregue medios para detener la actividad enzimática y recolectar las células en un tubo. Centrifugar y desechar el sobrenadante que contiene enzimas.

Resuspender las células en medios de cultivo neuronales libres de suero.

Siembre las células en pocillos de placas de pocillos múltiples recubiertos de gelatina.

incubar. Las células madre embrionarias se adhieren a la superficie recubierta de gelatina. Los componentes de los medios, incluidos los nutrientes, los factores de crecimiento y las hormonas, facilitan la proliferación celular y forman una monocapa.

A esta densidad celular, las células madre embrionarias producen y liberan niveles óptimos de factores de crecimiento y citocinas.

Estas moléculas desencadenan vías de señalización intracelular, facilitando la diferenciación de las células madre embrionarias en progenitores neurales.

Mezcle la gelatina con 500 mililitros de PBS tibio y cubra el fondo del recipiente de cultivo celular con la solución suficiente para cubrir la superficie. Mientras la gelatina se cubre, enjuague el cultivo subconfluente de células madre embrionarias de ratón dos veces en PBS. Luego, agregue 1 mililitro de reactivo de disociación al cultivo.

Después de dos a cinco minutos, golpee el recipiente para desalojar la monocapa en una suspensión unicelular y recolecte el cultivo en un total de 10 mililitros de medio y reactivo de disociación celular.

Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros y gírelas en una centrífuga. Luego, después de una aspiración cuidadosa del sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento en 10 mililitros de pipeteo N2B27 precalentado contra el costado del tubo para evitar la creación de burbujas.

Ahora, cuente las células que registran la concentración y vuelva a suspenderlas en el número apropiado de células por unidad de volumen por pocillo en N2B27 precalentado de acuerdo con la tabla. Luego, aspire la gelatina del recipiente de cultivo y coloque las células en placas sin agitar el recipiente.

Coloque los cultivos en una incubadora húmeda a 37 grados centígrados y dióxido de carbono al 5%, reemplazando el medio cada uno o dos días con N2B27 fresco.