Una técnica de cocultivo para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 3:14 min • July 8th, 2025
Tome un cultivo de células progenitoras neurales humanas, o NPC, apoyadas en una matriz extracelular.
Los NPC están diseñados para expresar una proteína fluorescente.
Deseche el medio y lave las células para eliminar cualquier medio residual.
Incubar el cultivo con enzimas que alteran la matriz, disociando las células.
Transfiera las células desprendidas a un tubo y agregue un medio para neutralizar la acción enzimática.
Centrifugar para granular las células, desechar el sobrenadante y volver a suspender las NPC en un medio de diferenciación neuronal.
Transfiera los NPC a un cocultivo establecido de astrocitos de ratón y neuronas corticales de rata.
Los factores de crecimiento liberados por el cocultivo establecido, junto con los contactos célula-célula de las NPC con las neuronas corticales y los astrocitos, promueven la diferenciación de las NPC en neuronas maduras.
Las neuronas maduras exhiben procesos celulares extendidos y forman conexiones sinápticas.
Bajo un microscopio confocal, use la señal de las proteínas fluorescentes para visualizar las neuronas humanas derivadas de NPC.
Después de generar células madre pluripotentes inducidas o iPSC, inducir y mantener las células como una célula progenitora neural humana o un cultivo de NPC de acuerdo con el protocolo de texto. En este ejemplo, los NPC se etiquetan utilizando el vector lentiviral Synapsin1-tdTomato. El día después de agregar neuronas primarias a un cultivo de astrocitos, use 1X PBS para lavar NPC humanos una vez. Luego, agregue la solución de desprendimiento celular e incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados.
Asegúrese de que todas las células se hayan desprendido, luego transfiéralas a un tubo de 15 mililitros que contenga el doble de DMEM / F12 y centrifugue a 200 g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y use un medio de diferenciación neuronal para resuspender suavemente el gránulo en células individuales. Use un hemocitómetro para contar las células.
A continuación, aspire cuidadosamente el medio de los cultivos de neuronas corticales de astrocitos. Coloque las NPC humanas a 5.000 células por centímetro cuadrado por pocillo en un medio de diferenciación neuronal. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de CO2 y reemplazar el medio cada dos o tres días durante al menos 28 días.
Para confirmar si las iPSC humanas se comportan como neuronas maduras, use un microscopio confocal equipado con una lente de inmersión en agua de 60x. Encontrar células diferenciadas de iPSC humanas mediante la visualización de tdTomato.
Descripción general
Este artículo describe un protocolo para diferenciar células progenitoras neuronales humanas (NPCs) en neuronas maduras utilizando un sistema de cultivo conjunto con astrocitos de ratón y neuronas corticales de rata. Las NPCs están modificadas genéticamente para expresar una proteína fluorescente con el fin de visualizarlas mediante microscopía confocal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación con células madre
Antecedentes
- Las células progenitoras neurales humanas (NPCs) pueden diferenciarse en neuronas.
- Los sistemas de co-cultivo pueden mejorar la diferenciación neuronal.
- Las proteínas fluorescentes permiten la visualización de las células diferenciadas.
- Comprender la diferenciación de NPCs es fundamental para la medicina regenerativa.
Objetivo del estudio
- Establecer un método confiable para diferenciar NPCs en neuronas maduras.
- Visualizar el proceso de diferenciación mediante marcadores fluorescentes.
- Explorar las interacciones entre NPCs y cultivos neuronales establecidos.
Métodos Utilizados
- Cultivo de NPCs humanos en una matriz extracelular.
- Disociación enzimática de NPCs a partir de la matriz.
- Co-cultivo con astrocitos de ratón y neuronas corticales de rata.
- Uso de microscopía confocal para visualizar neuronas diferenciadas.
Resultados principales
- Las CNP se diferenciaron con éxito en neuronas maduras.
- Las neuronas maduras exhibieron prolongaciones y conexiones sinápticas.
- La imagen fluorescente confirmó la presencia de neuronas diferenciadas.
- El sistema de co-cultivo promovió eficazmente la maduración neuronal.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método robusto para estudiar la diferenciación neuronal.
- El cultivo conjunto con astrocitos y neuronas corticales mejora la maduración de las NPC.
- Los marcadores fluorescentes son eficaces para rastrear la diferenciación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La diferenciación de células progenitoras neuronales humanas en neuronas funcionales es un paso fundamental en la validación de objetivos para modelos de enfermedades neurodegenerativas. Esta técnica de co-cultivo aumenta la confianza predictiva al proporcionar un sistema relevante para la enfermedad que permite reducir los riesgos mecanicistas de las hipótesis terapéuticas. El enfoque posibilita la preparación a escala de fenotipos neuronales validados para el desarrollo de ensayos posteriores y campañas de cribado.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la diferenciación de NPCs humanos en neuronas dentro de un microentorno fisiológicamente relevante.
- Valor operativo: Proporciona un sistema reproducible para la validación funcional de dianas utilizando NPCs humanos marcados con fluorescencia.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al generar neuronas relevantes para la enfermedad que exhiben fenotipos maduros, incluidos procesos prolongados y conexiones sinápticas.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Preparación para ensayos: Produce neuronas humanas diferenciadas adecuadas para ensayos cuantitativos basados en imágenes mediante microscopía confocal.
- Reproducibilidad: Condiciones de cultivo co-estandarizadas con astrocitos de ratón y neuronas corticales de rata promueven una diferenciación consistente de las NPC entre experimentos.
- Escalabilidad: El protocolo permite el siembra a densidades definidas (5.000 células/cm²), facilitando su adaptación a formatos de placas multipocillo para campañas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Genera neuronas derivadas de humanos que modelan la biología del sistema nervioso, lo que favorece la exploración traslacional de biomarcadores.
- Continuidad preclínica: Las neuronas diferenciadas mantienen la viabilidad durante al menos 28 días, lo que permite estudios longitudinales sobre la maduración y función neuronal.
- Avance ajustado al riesgo: El seguimiento fluorescente mediante tdTomato permite un monitoreo no invasivo de la eficiencia de diferenciación, reduciendo la variabilidad en la toma de decisiones preclínicas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la generación de NPC derivadas de células madre hasta ensayos neuronales funcionales, apoyando la identificación de compuestos activos mediante la selección fenotípica de los efectos de compuestos sobre la maduración y la conectividad.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa hipótesis sobre señales extrínsecas procedentes de astrocitos y neuronas corticales que inducen la diferenciación de las Células Progenitoras Neurales (NPC) y la maduración neuronal.
- Selección: Proporciona cultivos neuronales estandarizados con lecturas fluorescentes para imágenes automatizadas o de alto contenido que detecten cambios inducidos por compuestos en el crecimiento de neuritas o en la formación de sinapsis.
- Análisis: Permite mediciones cuantitativas de variables dependientes, como la longitud de los procesos, la intensidad de fluorescencia y la co-localización de marcadores pre y post-sinápticos mediante microscopía confocal.
- Investigación Traductiva: Utiliza NPCs derivadas de iPSC humanas para aumentar la relevancia de la especie en modelos preclínicos de trastornos neurológicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de diferenciación neuronal aplicable a múltiples clases de dianas y áreas terapéuticas en neurociencia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de diferenciación neuronal.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante pasos definidos de disociación, siembra y reemplazo del medio durante un período de diferenciación de 28 días.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar lecturas fenotípicas tempranas sobre la maduración neuronal y la conectividad.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en sus efectos en un sistema de co-cultivo de neuronas humanas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células madre, disociación enzimática y microscopía fluorescente.
- Depende del acceso a microscopía confocal con conjuntos de filtros adecuados para la detección de tdTomato.
- Necesita la estandarización del mantenimiento del co-cultivo, incluyendo la proporción astrocito-neurona y la frecuencia de cambio de medio.
- Implica consideraciones de adaptación al transferir el método a diferentes líneas de iPSC humanas o recubrimientos de matriz extracelular distintos.
- Está limitado por la naturaleza xenógena de la capa alimentadora de astrocitos de ratón y neuronas de rata, que podría influir en la cinética de maduración de las neuronas humanas.
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Última actualización: 29 agosto 2026