Una técnica de cocultivo para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas

Tome un cultivo de células progenitoras neurales humanas, o NPC, apoyadas en una matriz extracelular.

Los NPC están diseñados para expresar una proteína fluorescente.

Deseche el medio y lave las células para eliminar cualquier medio residual.

Incubar el cultivo con enzimas que alteran la matriz, disociando las células.

Transfiera las células desprendidas a un tubo y agregue un medio para neutralizar la acción enzimática.

Centrifugar para granular las células, desechar el sobrenadante y volver a suspender las NPC en un medio de diferenciación neuronal.

Transfiera los NPC a un cocultivo establecido de astrocitos de ratón y neuronas corticales de rata.

Los factores de crecimiento liberados por el cocultivo establecido, junto con los contactos célula-célula de las NPC con las neuronas corticales y los astrocitos, promueven la diferenciación de las NPC en neuronas maduras.

Las neuronas maduras exhiben procesos celulares extendidos y forman conexiones sinápticas.

Bajo un microscopio confocal, use la señal de las proteínas fluorescentes para visualizar las neuronas humanas derivadas de NPC.

Después de generar células madre pluripotentes inducidas o iPSC, inducir y mantener las células como una célula progenitora neural humana o un cultivo de NPC de acuerdo con el protocolo de texto. En este ejemplo, los NPC se etiquetan utilizando el vector lentiviral Synapsin1-tdTomato. El día después de agregar neuronas primarias a un cultivo de astrocitos, use 1X PBS para lavar NPC humanos una vez. Luego, agregue la solución de desprendimiento celular e incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados.

Asegúrese de que todas las células se hayan desprendido, luego transfiéralas a un tubo de 15 mililitros que contenga el doble de DMEM / F12 y centrifugue a 200 g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y use un medio de diferenciación neuronal para resuspender suavemente el gránulo en células individuales. Use un hemocitómetro para contar las células.

A continuación, aspire cuidadosamente el medio de los cultivos de neuronas corticales de astrocitos. Coloque las NPC humanas a 5.000 células por centímetro cuadrado por pocillo en un medio de diferenciación neuronal. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de CO₂ y reemplazar el medio cada dos o tres días durante al menos 28 días.

Para confirmar si las iPSC humanas se comportan como neuronas maduras, use un microscopio confocal equipado con una lente de inmersión en agua de 60x. Encontrar células diferenciadas de iPSC humanas mediante la visualización de tdTomato.