Un método in vitro para generar organoides cerebrales humanos
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 3:33 min • July 8th, 2025
Comience con un cultivo de neuroesferas, grupos flotantes de células progenitoras neuroepiteliales.
Transfiera estas neuroesferas a una hoja de inclusión.
Retire los medios. Agregue una gota de matriz de membrana extracelular que contenga proteínas y factores de crecimiento a cada neurosfera.
Incubar para que la matriz se solidifique, incrustando las neuroesferas dentro de ella.
Ahora, transfiera las neuroesferas incrustadas en la matriz utilizando medios de neuroesferas a una placa de cultivo que contenga medios de neuroesferas.
incubar. La matriz de la membrana extracelular y sus constituyentes facilitan la diferenciación de las células progenitoras neuroepiteliales en células neuroepiteliales que proliferan y forman lúmenes llenos de líquido.
Después de la incubación, transfiera las neuroesferas a un matraz giratorio que contiene medios organoides cerebrales precalentados. Incubar con agitación para mejorar la difusión de oxígeno y nutrientes, promoviendo el crecimiento celular.
Los factores de crecimiento y los inhibidores de moléculas pequeñas en los medios promueven la diferenciación neuronal y se convierten en células de regiones específicas del cerebro, formando organoides cerebrales maduros.
Para comenzar este procedimiento, recolecte las neuroesferas con una micropipeta de 200 microlitros, utilizando una punta de 2 milímetros previamente cortada con tijeras estériles. A continuación, coloque las neuroesferas aproximadamente a 5 milímetros de distancia entre sí en una película de parafina en un plato de 100 milímetros y retire con cuidado la mayor cantidad posible del medio restante. Luego, agregue una gota de matriz EHS en cada neuroesfera.
Incube las gotas de matriz EHS con las neuroesferas durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Después de eso, lave cuidadosamente las neuroesferas de la película de parafina enjuagándolas con medio neurosphere. Posteriormente, incube las neuroesferas durante los próximos cuatro días y agregue 2 mililitros de medio neurosférico fresco el segundo día.
En este procedimiento, agregue 100 mililitros de medio organoide cerebral a cada matraz giratorio a través de sus brazos laterales y precaliente el medio en la incubadora a 37 grados centígrados durante al menos 20 minutos. Luego, asegúrese de que todas las neuroesferas estén separadas. Si dos o más están conectados a través de una matriz EHS, sepárelos cortando la matriz de conexión con un bisturí.
Configure un programa de agitación a 25 RPM. Transfiera con cuidado las neuroesferas incrustadas en la matriz EHS a los matraces giratorios que contienen 100 mililitros de medio organoide. A continuación, coloque los matraces giratorios en una plataforma de agitación magnética en la incubadora durante 14 días a 37 grados centígrados. Este es el día cero de la cultura de los organoides. Cambie el medio una vez a la semana quitando la mitad del medio y agregando la misma cantidad de medio fresco.
Descripción general
Este artículo describe un método para diferenciar células progenitoras neuroepiteliales en organoides cerebrales maduros utilizando neuroesferas y una matriz extracelular. El proceso implica la inclusión de neuroesferas en una matriz, su incubación y posterior transferencia a un matraz agitador para mejorar el crecimiento.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Cultivo de Organoides
Antecedentes
- Las neuroesferas son agrupaciones de células progenitoras neuroepiteliales.
- Los componentes de la matriz extracelular son cruciales para la diferenciación celular.
- Los organoides cerebrales imitan la estructura y función del tejido cerebral real.
- Los matraces agitadores mejoran la difusión de nutrientes y oxígeno para el crecimiento celular.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para crear organoides cerebrales a partir de neuroesferas.
- Investigar la diferenciación de células progenitoras neuroepiteliales.
- Mejorar el crecimiento y la maduración de organoides cerebrales in vitro.
Métodos Utilizados
- Cultivo de neuroesferas y transferencia a una lámina de inclusión.
- Uso de matriz de membrana extracelular para la inclusión de neuroesferas.
- Incubación en matraces agitadores con medio para organoides cerebrales.
- Cambios regulares de medio para promover el crecimiento y la diferenciación.
Resultados principales
- Las neuroesferas se diferenciaron con éxito en células neuroepiteliales.
- Se formaron lúmenes llenos de líquido dentro de los organoides.
- Se observó un crecimiento mejorado con agitación en matraces giratorios.
- Se desarrollaron células de regiones cerebrales específicas a partir de las células progenitoras.
Conclusiones
- El método produce eficazmente organoides cerebrales maduros.
- Los componentes de la matriz extracelular son esenciales para la diferenciación.
- El cultivo en matraz agitador mejora el desarrollo de los organoides.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los organoides cerebrales humanos derivados de iPSC proporcionan un sistema fisiológicamente relevante para modelar el desarrollo neurotemprano y los mecanismos de enfermedad. Este método in vitro permite la validación de dianas y el cribado fenotípico en un contexto celular humano relevante para la enfermedad, apoyando la desactivación de riesgos mecanicistas en las líneas de descubrimiento. El enfoque mejora la confianza predictiva para candidatos terapéuticos dirigidos al SNC al reproducir la diferenciación específica de región y la organización semejante a tejido.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en un modelo neurodesarrollador humano con diferenciación específica por regiones.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional del objetivo mediante la observación de la formación de brotes neuroepiteliales y el desarrollo de la luz.
- Valor predictivo: Mejora la confianza en la interacción con el objetivo al modelar mecanismos patógenos tempranos en un sistema relevante para la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera organoides estandarizados y reproducibles con diferenciación neuroepitelial e identidad regional cuantificables.
- Valor operativo: La inclusión en matriz extracelular y el cultivo en matraces agitados permiten la preparación de ensayos escalables y compatibles con plataformas.
- Preparación para ensayos: Produce organoides maduros adecuados para cribado de compuestos y lecturas fenotípicas posteriores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta modelos derivados de iPSC con la validación preclínica mediante la formación de tejidos cerebrales estructurados y funcionales.
- Modelado de Enfermedades: Permite el estudio de trastornos neurodesarrolladores tempranos utilizando líneas específicas del paciente o isogénicas.
- Avance Ajustado al Riesgo: Facilita la evaluación de la modulación de dianas en un sistema humano complejo antes de las pruebas in vivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y la evaluación preclínica, proporcionando un puente relevante para el ser humano entre ensayos reduccionistas y modelos in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la diferenciación neuroepitelial y el patrón regional.
- Selección: Proporciona organoides listos para ensayos con formación estandarizada y resultados de diferenciación medibles.
- Análisis: Permite la evaluación cuantitativa de la eficiencia de diferenciación, la formación de lumen y la expresión de marcadores regionales.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento inicial con el trabajo preclínico mediante arquitectura tisular y complejidad celular relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma escalable y modular para uso repetido en múltiples objetivos e indicaciones.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva mediante modelado neurodesarrollador relevante para el ser humano y reducción de riesgos en objetivos.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de inclusión, incubación y agitación.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al reducir la incertidumbre biológica en la validación de objetivos del sistema nervioso central.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en resultados fenotípicos en un sistema similar al cerebro humano.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el cultivo de iPSC, diferenciación neuroepitelial y manipulación de tejidos en 3D.
- Depende del acceso a componentes de la matriz extracelular (por ejemplo, EHS) y biorreactores de matraces agitados.
- Necesita formulaciones estandarizadas de medios y preparación de neuroesferas con control de calidad.
- Implica consideraciones de adaptación para la ampliación en diferentes líneas celulares y fondos genéticos.
- Está limitado por la variabilidad entre lotes en el tamaño de los organoides y la eficiencia de diferenciación si no se aplican controles estrictos del proceso.
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Última actualización: 29 agosto 2026