Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:33 min. • July 8th, 2025
Comience con un cultivo de neuroesferas, grupos flotantes de células progenitoras neuroepiteliales.
Transfiera estas neuroesferas a una hoja de inclusión.
Retire los medios. Agregue una gota de matriz de membrana extracelular que contenga proteínas y factores de crecimiento a cada neurosfera.
Incubar para que la matriz se solidifique, incrustando las neuroesferas dentro de ella.
Ahora, transfiera las neuroesferas incrustadas en la matriz utilizando medios de neuroesferas a una placa de cultivo que contenga medios de neuroesferas.
incubar. La matriz de la membrana extracelular y sus constituyentes facilitan la diferenciación de las células progenitoras neuroepiteliales en células neuroepiteliales que proliferan y forman lúmenes llenos de líquido.
Después de la incubación, transfiera las neuroesferas a un matraz giratorio que contiene medios organoides cerebrales precalentados. Incubar con agitación para mejorar la difusión de oxígeno y nutrientes, promoviendo el crecimiento celular.
Los factores de crecimiento y los inhibidores de moléculas pequeñas en los medios promueven la diferenciación neuronal y se convierten en células de regiones específicas del cerebro, formando organoides cerebrales maduros.
Para comenzar este procedimiento, recolecte las neuroesferas con una micropipeta de 200 microlitros, utilizando una punta de 2 milímetros previamente cortada con tijeras estériles. A continuación, coloque las neuroesferas aproximadamente a 5 milímetros de distancia entre sí en una película de parafina en un plato de 100 milímetros y retire con cuidado la mayor cantidad posible del medio restante. Luego, agregue una gota de matriz EHS en cada neuroesfera.
Incube las gotas de matriz EHS con las neuroesferas durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Después de eso, lave cuidadosamente las neuroesferas de la película de parafina enjuagándolas con medio neurosphere. Posteriormente, incube las neuroesferas durante los próximos cuatro días y agregue 2 mililitros de medio neurosférico fresco el segundo día.
En este procedimiento, agregue 100 mililitros de medio organoide cerebral a cada matraz giratorio a través de sus brazos laterales y precaliente el medio en la incubadora a 37 grados centígrados durante al menos 20 minutos. Luego, asegúrese de que todas las neuroesferas estén separadas. Si dos o más están conectados a través de una matriz EHS, sepárelos cortando la matriz de conexión con un bisturí.
Configure un programa de agitación a 25 RPM. Transfiera con cuidado las neuroesferas incrustadas en la matriz EHS a los matraces giratorios que contienen 100 mililitros de medio organoide. A continuación, coloque los matraces giratorios en una plataforma de agitación magnética en la incubadora durante 14 días a 37 grados centígrados. Este es el día cero de la cultura de los organoides. Cambie el medio una vez a la semana quitando la mitad del medio y agregando la misma cantidad de medio fresco.